2023 Fiscal Year Annual Research Report
非線形ラマン散乱を用いた細胞内超硫黄分子のin situ検出と動的変化の解明
| Project Area | Life Science Innovation Driven by Supersulfide Biology |
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| Project/Area Number |
21H05261
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
中林 孝和 東北大学, 薬学研究科, 教授 (30311195)
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| Project Period (FY) |
2021-09-10 – 2026-03-31
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| Keywords | 超硫黄分子 / 非線形ラマン散乱 / ラマン顕微鏡 / 膜透過性高分子 / 量子化学計算 / 単一生細胞 / 濃度定量 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
単一生細胞内に超硫黄分子を導入し、細胞内での超硫黄分子の画像化、代謝過程をラマンイメージングを用いて観測することに成功した。試料としてジメチルトリスルフィドとコントロールとしてジメチルジスルフィドを用い、膜透過性高分子であるリン脂質高分子MPCを用いて水溶化させ、培養下にあるHeLa細胞内の高効率導入を行った。S-S伸縮振動バンドが細胞内で明瞭に観測され、S-Sバンドによるイメージング測定を行った。トリスルフィド体は、脂肪滴とミトコンドリアに選択的に局在することを示した。一方、ジスルフィド体はトリスルフィド体ほど細胞内に導入されず、脂肪滴にある程度局在するものの、ミトコンドリアへの局在は観測されなかった。また、トリスルフィド体に導入された脂肪滴はトリスルフィド以外のS-Sバンドが観測され、テトラスルフィドやペンタスルフィドなど硫黄鎖の伸長反応が生細胞内の脂肪滴で生じることを示した。オレイン酸のような脂質中では伸長反応が生じないことから、脂肪滴内の酵素によって伸長反応が生じたと考えられる。私達が提案することができた水のラマンバンドを用いた濃度定量法を単一生細胞内にある超硫黄分子に適用し、超硫黄分子の濃度定量・濃度イメージングも行うことができた。前年度に製作した非線形ラマン散乱であるCARS顕微鏡に改良を加え感度向上を行い、次年度ではPMCを用いた超硫黄分子の細胞内導入過程をリアルタイムで観測することを予定している。また2次元相関、機械学習などの振動スペクトルの解析法の開発・整備も引き続き行った。超硫黄分子の細胞内導入に伴う細胞状態変化の検出をこれらの解析法を用いて行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
超硫黄分子の細胞内ラマンイメージングの測定は硫黄単体であるS8以外では初めてであると思われる。細胞内分布や代謝なども信号雑音比が高く観測することができた。CARS顕微鏡と組み合わせることで超硫黄の動態を明らかにできると考えている。振動スペクトルの解析手法の蓄積も行い、おおむね順調に進展しているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
超硫黄分子の細胞内導入と代謝過程のラマンイメージング測定のプロコトルを確立できたため、他の超硫黄分子への展開、製作したCARS顕微鏡への応用を行う。硫黄鎖依存性、量子化学計算を用いた代謝化合物の同定も行う。今年度できなかった蛍光寿命との組み合わせも行う予定である。2次元相関、機械学習、多変量スペクトル解析などのラマンスペクトルの解析法を用いて、超硫黄分子の細胞内導入に伴う細胞状態変化、細胞内分子の濃度変化の定量なども行う。
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