2013 Fiscal Year Annual Research Report
シグナル制御複合体の構造と細胞内局在の電子顕微鏡解析
| Project Area | Structural basis of cell-signalling complexes mediating signal perception, transduction and responses |
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| Project/Area Number |
22121004
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
佐藤 主税 独立行政法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 研究グループ長 (00357146)
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| Project Period (FY) |
2010-06-23 – 2015-03-31
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| Keywords | シグナル伝達 / 分子複合体 / 電子顕微鏡 / タンパク質構造 / イオンチャネル |
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| Research Abstract |
TEMを用いた単粒子画像解析法は、精製された個々のタンパク質の電顕像から画像処理により３次元構造を計算する方法である。結晶を必要としないため、結晶作製が難しい複合体の構造解析に大きく貢献することが期待されている。元来は、比較的鮮明な画像が期待されるウィルスや巨大タンパク質を得意とする方法で、USAを中心として対称性の高いウィルス外殻で4Åを上回る分解能が達成された。近年では、数百kDaの比較的大きな4対称膜タンパク質で原子分解能が達成された。しかし、もっと小さな通常サイズの分子の解析が強く求められている。本手法は情報学とバイオの学際領域にあり、縦割社会の日本では研究者は少ない。分野を超えた研究展開が求められている。我々は、柔らかい情報処理を取り入れた新手法を開発してきている。さらに本年度は、新たな単粒子解析法の論文を出した。すなわち、確立概念に基づく新たなアルゴリズムによる粒子拾い上げ法と、work flowの最適化による自動化解析法を、Microscopy誌に２報の論文として報告した。
また、シグナル制御複合体を理解するには、細胞レベルでの研究も重要である。これら複合体は、一般に細胞内でダイナミックに会合・離散しながら機能を発揮するものが多い。光学顕微鏡観察は液中の細胞を観察できるが、光の波長は紫外線でも200nmであるので、この値を飛躍的に上回る分解能は期待できない。そのため、細胞を水溶液中で高分解能観察できる顕微鏡が求められていた。我々が開発したASEMは、解放環境にある溶液中の細胞が観察できる倒立型走査電顕である。細胞は固定するだけで水溶液中の自然な状態で観察できる。8nm分解能を有する。ASEMに正チャージ金によるラベル法を応用し、細胞の糖や細胞膜のラベルに有効であることを示した。さらに、細菌の鞭毛と線毛のラベルに成功した(Microscopy Research and Technique, 2014)。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本計画研究では、単粒子解析に関しては独自のアルゴリズム開発に成功して(microscopy,2013aと2013b)、SPPとMicrotubuleというシグナル伝達に重要な２つのタンパク質の詳細構造を解明することに成功した (JBC 2011, JCB 2012)。また、これまで難しかった1 micrometerを下回るタンパク質微結晶の詳細構造を、ASEMで液体中で観察・同定できるようになったのは、我々のグループの電子顕微鏡技術と千田グループの結晶化技術の融合研究による成果であるため。この手法は、全く新しい結晶スクリーニングの方向性と考える（IJMS 2012）。また、ASEMによる液中免疫電顕法の論文と(JSB 2012)、そこでの初代培養細胞の活用ができたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
単粒子解析法の精度を情報学的手法等を用いて向上させる。開発された方法を用いて、同領域内で連携して、シグナル伝達複合体を解析する。また、チューブリン、チャンネルの構造解析をさらに進め、タンパク質の分泌に重要なSecDFの構造変化を解明し、領域内外での共同研究を展開する。 ASEMに関しては、観察効率を上げるために、8枚窓ASEM dishを開発する。また、ASEMのサンプル側に関しては、細胞内の様々な構造を高コントラストで迅速に観察するために、 細胞内小器官を染め分けることを可能にする染色液を開発する。さらに、リガンドや抗体などによるASEMに効果的な標識ラベル法を開発する。ASEM法を改良してタンパク質結晶の高スループット観察を実現し、本領域の千田等とシグナル複合体の結晶化に向けての共同研究を展開する。
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[Journal Article] Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of hepatitis B virus core protein dimerized via a peptide linker containing an EGFP insertion2013
Author(s)
M.Kikuchi, S.Iwabuchi, T.Kikkou, K.Noguchi, M.Odaka, M.Yohda, M.Kawata, C.Sato, O.Matsumoto
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Journal Title
Acta Cryst
Volume: F69
Pages: 942～945
DOI
Peer Reviewed
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