2012 Fiscal Year Annual Research Report
Structural basis for nuclear transport mechanism by the nuclear transport receptor and improvement of a synchrotron beamline.
| Project Area | Structural basis of cell-signalling complexes mediating signal perception, transduction and responses |
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| Project/Area Number |
22121006
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
山下 栄樹 大阪大学, たんぱく質研究所, 助教 (00294132)
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| Project Period (FY) |
2010-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 核細胞質間輸送因子 / X線結晶構造解析 / 放射光 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
真核生物では、遺伝情報を保持する核と蛋白質合成の場である細胞質が、核膜によって隔てられているため、細胞が正常にかつ効率よく機能するためには、核と細胞質の間で連携した核膜を介した物質輸送が必要である。核―細胞質間物質輸送では、輸送担体が分子量の大きな積荷分子を認識し、輸送担体-積荷分子複合体を形成し核膜を通過する。本研究では、核―細胞質間物質輸送において、輸送担体がどのように積荷分子を認識し、どのような仕組みで核膜を通過するのかを、放射光を用いた高精度測定により得られる高精度の複合体構造に基づいて明らかにする。本年度は、RNAの核外輸送に関わる複合体の構造解析と放射光ビームラインのミニビーム化に対応するため昨年度導入した高精度高速試料回転軸の安定化対策の検討を行った。
RNAの核外輸送に関わる複合体（tRNA/exportin-5/RanGTP）の試料調製では、RanGTPの精製標品に含まれる核酸の持込を減らすことにより、複合体の収量を7～8倍上げることに成功した。同質の複合体精製標品を用いて多くの結晶化条件の探索が可能になった。
exportin-5単体の構造変化を観測するために、X線小角実験及び結晶構造解析を行った。X線小角実験では、溶液状態でexportin-5が安定な溶液条件を探索し、単分散の散乱パターンが得られるようになった。単分散の散乱パターンが得られた条件を基に結晶化を行っていたところ、針状結晶が得られた。
昨年度導入した高精度高速試料回転軸を利用することで測定位置をより精密に合わせられるようになったが、X線光軸から回転中心が10umぐらいずれることがあった。高精度高速試料回転軸を安定に保持できるように、回転軸を光軸に合わせるための調整軸と試料を回転中心に合わせる調整軸の改良を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
持込の核酸を除去するために陰イオン交換カラムをRanGTPの精製時に用いることにより、tRNA/exportin-5/RanGTP 複合体の収量を劇的に向上させることに成功し、結晶化条件の探索が可能になった。exportin-5は柔軟な蛋白質であると考えられており、単体での結晶構造解析は難しいと考えられていたが、針状結晶が得られたことにより、より高分解能の構造情報が得られる可能性がでてきた。
放射光測定法の改良では、高精度高速試料回転軸とX線光軸を簡便に合わせられ、回転軸の位置を安定に保持できるようになった。このことにより、インバースビーム測定の時間を短縮することが可能になった。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞分化に関わる転写因子の核輸送担体の発現精製系の構築及び放射光を利用した高精度データ収集方法の開発について、効率的に研究を推進するために、新たに２名の研究協力者を加えて行う。細胞分化に関わる転写因子-輸送担体複合体の構造研究では、精密な結合様式を明らかにするために、転写因子認識部位-輸送担体複合体の構造解析も行う。RNAの核外輸送に関わる複合体の結晶構造解析については当初計画通りに進める。Exportin-5単体の構造解析については、微結晶が得られたので、小角散乱パターンの解析を進めると共に、結晶構造解析も行い、高分解能での構造変化を観測する。
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