核輸送関連の核内複合体の構造解析と放射光測定法の改良

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Structural basis of cell-signalling complexes mediating signal perception, transduction and responses
• Project/Area Number: 22121006
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 山下 栄樹 大阪大学, たんぱく質研究所, 助教 (00294132)
• Project Period (FY): 2010-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 細胞構造生物 / 核-細胞質間輸送 / X線結晶構造解析 / 放射光

Outline of Annual Research Achievements

真核生物では、細胞が正常にかつ効率よく機能するためには、核と細胞質の間で連携した物質輸送が必要である。核―細胞質間物質輸送では、輸送担体が分子量の大きな積荷分子を認識し、輸送担体-積荷分子複合体を形成し核膜を通過する。本研究では、核―細胞質間物質輸送において、輸送担体がどのように積荷分子を認識し、どのような仕組みで核膜を通過するのかを、放射光を用いた高精度測定により得られる高精度の複合体構造に基づいて明らかにする。本年度は、RNAの核外輸送に関わる複合体及び転写因子の核輸送に関わる複合体構造解析の構造解析に向けて以下のことを実施した。また、回折強度データの精度を上げるために、吹き付け装置の改良を行った。
I. RNAの核外輸送に関わる複合体の結晶構造解析
（１）tRNA/exportin-5/RanGTP３者複合体の結晶化について、数千種類の条件で探索を行った。（２）eEF1aの精製に成功し、tRNA/exportin-5/RanGTP/eEF1aの4者複合体の安定化条件の検討を行った。（３）3.5A分解能でexportin-5の結晶構造を行い、既報の3者複合体ではdisorderしていたexportin-5のc末端領域が観測できた。exportin-5の構造から、exportin-5がRNAを捉えるための構造変化が明らかになった。
II. 細胞分化に関わる核輸送の構造研究
（１）importin-α1と認識ペプチド（NLSペプチド）との複合体の構造解析の結果、新しい結合部位として可能性のある部位が見つかった。（２）Oct3/4とOct6のimportin-α1に対する相互作用の差異を理解するためにimportin-α1とOct6との複合体の形成条件の検討を行った。Oct6との複合体はOct4との複合体に比べ溶解度が低いことが分かった。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Structural and functional analysis of Hikeshi, a new nuclear transport receptor of Hsp70s. (2015)
  • Author(s): Song J, Kose S, Watanabe A, Son SY, Choi S, Hong H, Yamashita E, Park IY, Imamoto N, Lee SJ.
  • Journal Title: Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. Volume: 71 Pages: 473-483
  • DOI: 10.1107/S1399004714026881.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural basis for the selective nuclear import of the C2H2 zinc-finger protein Snail by importin β. (2014)
  • Author(s): Choi S., Yamashita E., Yasuhara N., Song J., Son S.Y., Won Y.H., Hong H.R., Shin Y.S., Sekimoto T., Park I.Y., Yoneda Y., Lee S.J.
  • Journal Title: Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. Volume: 70 Pages: 1050-1060
  • DOI: 10.1107/S1399004714000972.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] SPring-8 BL44XU, Beamline Designed for a Structure Analysis of Large Biological Macromolecular Assemblies (2015)
  • Author(s): Akifumi Higashiura*, Eiki Yamashita*, Masato Yoshimura, Kazuya Hasegawa, Yukito Furukawa, Takashi Kumasaka, Go Ueno, Masaki Yamamoto, Tomitake Tsukihara, Atsushi Nakagawa
  • Organizer: The 12th International Conference on Synchrotron Radiation Instrumentation (SRI 2015)
  • Place of Presentation: New York City
  • Year and Date: 2015-07-06 – 2015-07-10
• [Presentation] 核外輸送におけるExportin-5の構造基盤 (2015)
  • Author(s): 山澤龍治，小林武，慈幸千真理，月原冨武，中川敦史，山下栄樹
  • Organizer: 第15回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: あわぎんホール
  • Year and Date: 2015-06-24 – 2015-06-26
• [Presentation] SPring-8生体超分子複合体構造解析ビームライン（大阪大学蛋白質研究所）BL44XUの現状 (2015)
  • Author(s): 山下栄樹, 東浦彰史, 吉村政人, 長谷川和也, 熊坂崇，古川行人，大端通，上野剛，山本雅貴，吉川信也，月原冨武，中川敦史
  • Organizer: 第28回日本放射光学会年会放射光科学合同シンポジウム
  • Place of Presentation: 立命館大学びわこ・くさつキャンパス
  • Year and Date: 2015-01-10 – 2015-01-12
• [Presentation] IPR Beamline for Macromolecular Assemblies at SPring-8 (BL44XU) (2014)
  • Author(s): Eiki Yamashita, Akifumi Higashiura, Masato Yoshimura, Kazuya Hasegawa, Yukito Furukawa, Toru Ohata, Takashi Kumasaka, Go Ueno, Masaki Yamamoto, Atsushi Nakagawa
  • Organizer: 23rd Congress and General Assembly of the International Union of Crystallography (IUCr2014)
  • Place of Presentation: Montreal
  • Year and Date: 2014-08-05 – 2014-08-12