2012 Fiscal Year Annual Research Report
Study of the occurrence of mutations and adaptive genome evolution via genomic analyses
| Project Area | Systematic study of chromosome adaptation |
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| Project/Area Number |
22125009
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
渡邉 日出海 北海道大学, 情報科学研究科, 教授 (30322754)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小柳 香奈子 北海道大学, 情報科学研究科, 准教授 (20362840)
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| Project Period (FY) |
2010-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 二本鎖DNA切断修復 / 組換え / 突然変異 / 酵母 / ヒトアデノウイルス / 非相同末端結合 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
新たに導入した次世代型パーソナルシーケンサーIon PGMと従来のAB3130xlを用いて、内外の共同研究者から受け取った多数のHAdVおよび酵母のゲノム配列決定を行った。ヒトのみを宿主とするHAdV-D種に加えて、他種HAdVおよびヒト以外を宿主とするAdVゲノム解析も行い、組換えホットスポットの存在を明らかにした。さらに、組換え・突然変異発生特性の普遍性と系統特異性の解析を行い、AdVの適応的進化に関連するゲノム領域を推定するとともに、ゲノム配列解析以外に、ウイルス表面タンパク質の立体構造を高精度で予測し、組換えおよび塩基・アミノ酸置換速度の高い領域がエピトープ領域候補に対応することを明らかにした。また、真核生物ゲノム内にINDELをもたらす原因とそのINDEL発生特性を明らかにすることを目的として、二本鎖DNA切断(DSB)に対して働くHR、NHEJ、MMEJ、SSAの修復機構に着目している。これらの機構によりDSBが再結合される際に、数塩基またはより長いINDELが生じる場合があることが知られている。未解明なそれらの基本発生特性と分子機構を明らかにするために、Ion PGMおよび領域内で導入しているIllumina社のMiSeqを用い、本領域A03の白髭グループが長年ChIP-chip/seq解析対象としきた出芽酵母BY4741株(半数体)およびその遺伝子KO株に対して、G1期に人為的にDSBを導入し、その修復を検出するための方法を開発した。現在、DSBの正確な数とその存在場所を明らかにしている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々の身近な感染症である流行性角結膜炎やプール熱などの原因であり、定点観測や国際ネットワークによるウイルス試料の蓄積が進んでいたHAdVのゲノム変化特性を明らかにすることを目指した。そのために、内外の多くの眼科医や感染症研究所等との国際共同研究の形で多数のHAdVゲノムについて多面的に解析を行い、異系統間でゲノム組換えが高頻度で起きていること、また、その組換え領域が特定の領域に偏在していること（ホットスポットの存在）、それらが、ウイルス粒子表面に存在するタンパク質をコードしている遺伝子を多く含んでおり、組換えが自然選択の対象となってきた可能性があることなどを明らかにしてきた。さらに、細胞増殖等の過程で働く自然選択の影響を受ける前の、DSB修復直後のゲノム構造変化を捉えることを目的として、G1期同調半数性酵母細胞への人為的DSB導入後、G1/Sチェックポイントを通過した細胞をG2/M期でarrestし、次世代シーケンサーで配列決定するという方法を考案し、平成24年度にこの方法が有効であることを実証している。また、真核生物のDSB修復系としてHRやNHEJ、SSAの存在が知られていたが、最近になってMMEJも知られるようになり、これらを区別してゲノム変化特性を解析する必要があることがわかってきた。そこで、半数性細胞において姉妹染色分体が存在しないためにHRが抑制されているG1期におけるDSB修復に着目することにより、非HR修復によるゲノム構造変化を明らかにすることとした。この研究を加えることにより、本研究課題は、全体としてのゲノム変化特性の把握ばかりでなく、その背景に存在する個別の分子機構による突然変異発生特性をも解明することが可能となった。 以上のように、ゲノムアダプテーションのより深い理解が進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成24年度に独自にゲノム配列決定を行ったBY4741株（白髭グループより譲り受けたもの）を、正確に突然変異を検出のための参照配列として用い、同株に対してin vivoで人為的に導入したDSBの位置と数を正確に明らかにする（DSB発生特性の解明）。そのために、DSB発生箇所を簡便かつ高速に同定するための独自の方法を確立する。次に、それらのDSBが修復され、G1/Sチェックポイントを通過した直後のゲノムを配列決定することにより、修復機構による再結合の際に生じる突然変異を検出する（突然変異発生特性の解明）。NEJ1欠損株、RAD1欠損株、独自作製のダブルノックアウト株なども併用して、真核生物のDSB修復系として知られているHR、NHEJ、MMEJ、SSA各々の特性を区別する。これらの解析の過程で、特にあまり解明されていないMMEJとSSAの分子機構に関する知見が得られれば、適宜、論文として報告する。これらの解析方法の有効性が確認出来場合には、ほ乳類を用いた解析を進める。
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