2011 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Coupling of replication, repair and transcription, and their common mechanism of chromatin remodeling |
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| Project/Area Number |
22131007
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
山縣 ゆり子 熊本大学, 大学院・生命科学研究部, 教授 (40183678)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森岡 弘志 熊本大学, 大学院・生命科学研究部, 教授 (20230097)
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| Keywords | 構造生物学 / クロマチンリモデリング / ゲノムメンテナンス / タンパク質の大量調製 / タンパク質の結晶化 |
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| Research Abstract |
構造生物学は生命現象の各場面を原子レベルの化学の言葉で記述することに成功し、生命科学の発展に貢献してきた。本研究ではゲノム修復、複製、転写のカップリングと普遍的なクロマチンリモデリング機構の原子レベルでの解明を目的に、ゲノムメンテナンスとクロマチンリモデリングに関わる重要なタンパク質の構造生物学的研究を行っている。平成23年度は前年度にほぼ高純度大量調製法を確立したDNAメチル化保護に関わるヒストンメチル化結合タンパク質、新規AP-エンドヌクレアーゼ、ISWIファミリーのタンパク質複合体の中の2サブユニット、さらに以前からほぼ精製法が確立していたRad18/6複合体、MUTYH等についてより結晶生成の確率が向上するように、タグの変更やタグの切除、タンパク質の一部を欠損させたり、置換体を用いたり、Rad6のように2箇所から転写開始が始まる可能性のある配列を改変したり、複合体形成させ結晶化を有利にさせる等、結晶化試料調製に様々な工夫を加え、結晶化を試みた。現在のところ構造解析可能な結晶は得られていないが、微小結晶が得られる確率は増えており、結晶化に適した高純度タンパク質の大量調製に関して随分改善が見られた。さらにISWIファミリタンパク質超分子複合体調製に向けての構成タンパク質フラグメントの大量調製も昆虫細胞を用いたものも加え、進みつつある。その構成タンパク質間の一部について親和性に関する知見についてSPR法により得ることができた。水素原子の位置のレベルでの働く仕組みの解明の課題では、特にゲノムの酸化損傷を防ぐヒトMTH1の中性子構造解析と超高分解能X線構造解析を合わせて行うために、JAXAが行っている宇宙での結晶化実験に参加、地上での結晶化よりも高分解能の結晶を得ることが出来た。中性子構造解析のために必要な大型結晶についても一辺が1mm程度の結晶が調製できるようになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究で最も困難なところは研究対象としているゲノムメンテナンスとクロマチンリモデリングに関わる幾つかの重要なタンパク質を大量調製し、結晶化することで、これに関して現在のところ構造解析可能な結晶は得られていないが、微小結晶が得られる確率は増えている。さらに、水素原子の位置のレベルでの働く仕組みの解明の課題では、hMTH1についてJAXAによる宇宙での結晶化実験で分解能の向上がみられ、中性子構造解析のために必要な大型結晶についても一辺が1mm程度の結晶が調製できるようになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究で最も困難なところは研究対象としているゲノムメンテナンスとクロマチンリモデリングに関わる幾つかの重要なタンパク質を大量調製し、構造解析可能な結晶を得るところであるが、様々な大量調製の工夫により、微小結晶が得られる確率は増えている。特に、目的タンパク質やタンパク質複合体を立体構造レベルで単一に、しかも安定的に調製することが重要であるので、これを指標に、SPR法等を利用して親和性を高めるタンパク質フラグメントの調製など、それぞれのタンパク質に応じた更なる工夫を行い、構造解析可能な結晶を得る予定である。
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