2023 Fiscal Year Annual Research Report
Saliva of hematophagous arthropods -Pharmacological analysis for the drug discovery-
| Project Area | Parasitomimetics: Identification and application of highly functional factors of parasites |
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| Project/Area Number |
22H05059
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
八田 岳士 北里大学, 医学部, 准教授 (00455304)
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| Project Period (FY) |
2022-05-20 – 2025-03-31
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| Keywords | 外部寄生虫 / 唾液分子 / 産業応用 / ヒスタミン結合タンパク質 / マダニ / 昆虫細胞分泌発現系 / piggyBac |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マダニは長期間の吸血において多種多様な薬理物質を宿主体内に放出する。本研究は、①抗アレルギー物質、②抗血液凝固物質、③血管新生抑制物質に関連するマダニ唾液分子について、分子機能・構造など科学的根拠に裏付けられた新薬創製のシーズを得ることを目的としている。本年度は、ヒスタミン結合蛋白質の機能解析を主に行った。フタトゲチマダニ唾液腺発現遺伝子のESTデータベースに対し、HLCBP1をクエリとしたBlastn解析を行い、E-valueが0.00001未満となる遺伝子10個を選出した。これらについて、唾液腺におけるmRNA発現解析を行ったところ、8個の遺伝子で吸血刺激による発現の上昇を認めた。遺伝子配列をもとに機能予測を行ったところ、S02086A-40_F06の予測アミノ酸配列に、Histamine結合ドメインが保存されていることが分かった（以下、HLHBP1とする）。HLHBP1遺伝子ノックダウン（KD）マダニにおける吸血や産卵などの表現型解析を実施したところ、対照群よりも吸血時の成長が抑制される現象を認めたが飽血時体重は有意に重くなっていた。予備データではあるが、刺咬部位皮膚では肥満細胞およびT細胞が顕著に集簇していたことから、対照群とは異なる炎症性変化が生じている可能性がある。次に本分子の組換えタンパク質の発現系の構築を行った。昆虫細胞系での高レベル分泌発現を企図し、まずリーダーシグナルとしてメリチンを融合した分子キメラとして塩基配列をデザインした。本ベクターをSf9細胞へ導入し、1週間薬剤選択してから培養上清中を解析したところ、HLHBP1の分泌発現を確認することができた。今後、高レベル発現を企図して、本キメラ遺伝子をトランスポゾンpiggyBacの末端逆位配列の間に導入したベクターを構築し、ヘルパーとともにトランスフェクトしたSf9細胞を作出することを計画している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
HLCBP1の組換えタンパク質の機能確認が進んでいない。そのため、次点で進めていたHLHBP1に注力することとなった。昆虫細胞を用いた安定発現系の構築に至ったが、今後先行していたHLCBP1の分子機能解析についても進めていく。このため、当初計画とは異なる手段をとることとなったため、やや遅れているという評価となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
HLHBP1のpiggyBacを利用した高レベル分泌蛋白質発現系の構築をベンチマークとして、解析の遅れているHLCBP1についても分子機能解析を進める。具体的には以下の実験系を進めていく予定である。
①抗アレルギー物質の機能解析（特にHLHBP1）：マダニ唾液分子発現Sf9細胞の培養上清、または精製タンパク質を用い、炎症性メディエーターに対する結合能について評価を行う。
②抗止血物質の解析：上記と同様の培養上清を用い、APTT法やPT法などのクロット析出時間を指標に評価する。
③血管新生抑制物質の解析：上記と同様の培養上清を用い、HUVECなどの血管内皮細胞の
増殖率や脈管形成率を指標に評価する。
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[Journal Article] RNA activation in ticks2023
Author(s)
Kwofie Kofi Dadzie、Hernandez Emmanuel Pacia、Anisuzzaman、Kawada Hayato、Koike Yuki、Sasaki Sana、Inoue Takahiro、Jimbo Kei、Mikami Fusako、Ladzekpo Danielle、Umemiya-Shirafuji Rika、Yamaji Kayoko、Tanaka Tetsuya、Matsubayashi Makoto、Alim Md Abdul、Dadzie Samuel Kweku、Iwanaga Shiroh、Tsuji Naotoshi、Hatta Takeshi
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 13
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] 2022年度神奈川県立津久井湖城山公園マダニ調査報告2023
Author(s)
神保 惠, Danielle Ladzekpo, 川田 逸人, Meryem Behri, 小池 優貴, 佐々木 紗己, 佐々木 萌可, 中島 政斗, 上松 史尚, 松田 洋志郎, 三角 修斗, 三上 房子, 辻 尚利, 八田 岳士
Organizer
PPEZ2023
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[Presentation] Demonstrating the presence of RNA activation in Ticks2023
Author(s)
Kofi Dadzie Kwofie, Emmanuel Pacia Hernandez, Anisuzzaman, Hayato Kawada, Yuki Koike, Sana Sasaki, Takahiro Inoue, Kei Jimbo, Fusako Mikami, Danielle Ladzekpo, Rika Umemiya-Shirafuji, Kayoko Yamaji, Tetsuya Tanaka, Makoto Matsubayashi, Md Abdul Alim, Samuel Kweku Dadzie, Shiroh Iwanaga, Naotoshi Tsuji, Takeshi Hatta
Organizer
PPEZ2023
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