2014 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Chemical Biology using bioactive natural products as specific ligands: identification of molecular targets and regulation of bioactivity |
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| Project/Area Number |
23102015
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
西川 俊夫 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (90208158)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
此木 敬一 東北大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (40292825)
安立 昌篤 名古屋大学, 生命農学研究科, 助教 (80432251)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | テトロドトキシン / サキシトキシン / 電位依存性ナトリウムチャネル / 阻害剤 / サブタイプ選択性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(1) テトロドトキシン（TTX）アナログの合成：本年度は、6-epi TTXと8-epi TTXの合成を検討した。まず、TTXとチリキトキシンの全合成の中間体の6, 11位のジオール構造をexo-オレフィンに変換し、OsO4によるジヒドロキシル化によって6-epi 構造を優先して得る条件を見いだした。この生成物を利用して、6-epiTTXに変換可能な天然物4,9-anhydro-6-epi TTXの合成に成功した。一方、8-epiTTXの合成は、8位水酸基の立体配置を反転した中間体の環内オレフィンのエポキシ化が進行せず、エポキシ化してから８位水酸基の立体配置を反転するルートに方針を転換した。
(2) サキシトキシン（STX）のアナログ合成：連続環化反応によって合成したspiro-アミナール生成物のSTX三環性骨格への変換を検討した。まず、ジオールを酸化切断し、ヘミアミナールを含む環状ウレア構造を合成した。ついで、ヒドロキシメチル基の等価体としてニトリルを導入し、STXの全炭素骨格の揃った化合物を得た。最後に残った課題「環状ウレアのグアニジンへの変換」は、モデル実験によって解決した。
(3)ナトリウムチャネル（Nav）の阻害活性評価：自動パッチクランプ実験装置（自動型装置）を用いてTTXを含む幾つかのアナログのNav阻害活性を測定した。その結果、TTXは文献通りの阻害活性が観測され、あるアナログ（以下アナログX）についてはNav1.5を阻害する活性が観測された。しかし、昨年度同様、Nav1.4、Nav1.5の安定発現株の維持が困難で、再現性が確認できなかった。そこで、手動パッチクランプ実験装置を立ち上げ、Navを一過性発現するHEK293T細胞に対してパッチクランプ実験を開始した。その結果、アナログXはNav1.5を不可逆的に阻害することが明らかとなった。その他アナログについてもNav1.5の他、Nav1.2、Nav1.4に対する阻害活性を明らかにしつつある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
（１）TTXアナログの合成：8-epi TTX体の合成が遅れている。これまでのTTXアナログ合成で利用してきた方法が使えなかった事が原因である。
（２）STXアナログの合成：H26年度にSTX合成に必要なすべての課題を個別に解決したので、今年度中には全体の遅れを取り戻すことができると考えている。
（３）ナトリウムイオンチャネルの阻害活性評価：当初、自動型装置で効率よく成果を挙げられなかったことが響いており、全体的には遅延と言わざるを得ない。H26年度に関しては順調であり、その効率を維持し成果を出し続けたいと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）TTXアナログの合成：昨年度の研究で、8-epi TTXの合成中間体の示す特殊な反応性が明らかになった。そこで、８位の立体配置の反転を合成の終盤で行うルートに変更することを検討する。
（２）STXアナログの合成：早急に STXの中心骨格の合成を終え、アナログの合成を進める。
（３）ナトリウムイオンチャネルの阻害活性評価： 基本的には、昨年度の継続である。手動型装置を用い、各種Navサブタイプに対する各アナログの結合性評価を行う。サブタイプ数とアナログ数が増えたため、手動型パッチクランプ実験を行う前に予備実験を挿入したい。パイロット実験とは、ウアバイン、ベラトリジンにより細胞を瀕死の状態にしておき、別途添加したTTXアナログが細胞生存率をどれだけ回復させるを調べる実験で、以前よりNeuro 2A細胞に対して行っていた実験手法を登用する。ただし、特定のサブタイプを安定発現する細胞を用いて行う計画である。そのためには、安定発現株の樹立が必要であるが、手動パッチクランプ実験に必要な細胞の調製とは異なり、より簡便に行う計画である。
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