2011 Fiscal Year Annual Research Report
複製フォークの安定化機構とその破綻による病態の解析
| Project Area | Functions of non-coding DNA region for genome integrity |
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| Project/Area Number |
23114010
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
高田 穣 京都大学, 放射線生物研究センター, 教授 (30281728)
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| Keywords | DNA複製フォーク / 染色体ストレス / チェックポイント / 染色体脆弱部位 / クロマチン / ファンコニ貧血 / ATRIP-ATR |
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| Research Abstract |
1)染色体ストレス高感受性部位の網羅的解析:染色体ストレス高感受性部位を同定し、その性状を解析するため、まずATRIP、FANCD2に対する抗体を作成中である。両者のGST融合蛋白質を大腸菌から精製し、ウサギ二匹づつに免疫を行っている。また、GFPやFLAG-HAタグを付加したATRIP、FANCD2等のDNA損傷応答タンパク質を発現するヒト細胞株を入手、作成した。最低限これらの細胞を使用して検討は可能であるが、さらに、タグ配列を内在性遺伝子座にノックインした細胞を作成するのが望ましいと考え、最近注目のゲノム編集法であるTALENの導入を開始した。一方、ニワトリDT40細胞におけるfragile siteの同定のため、ヒト細胞と同様のプロトコールで染色体断裂の誘導を試みたが、不調に終わった。さらに、ヒト3番染色体をもつDT40を鳥取大学押村教授より入手し、同様に調べたが、染色体断裂は観察できなかった。ニワトリ細胞でもヒトなどのfragileサイトに相当する遺伝子は保存されているが、その性質は異なっていると考えられ、ニワトリにおける染色体断裂としてのfragile siteの検討は不可能であると判断した。
2)複合体プロテオミクスによる複製フォーク安定化と崩壊機構の解析:Hela S3細胞に、ATRIP、FANCD2、FANCI、FANCLなどをFLAG-HAタグを付加してレトロウイルスで発現させた。これらの因子の複合体精製を行い、新規の会合因子を複数同定することに成功した。染色体ストレス下のATRのリン酸化基質の網羅的同定を目指し、Silac法の検討を開始した。
3)染色体ストレス下のチェックポイントキナーゼATRIP-ATR初期活性化機構の解析:染色体ストレスの初期応答においては、中心分子であるATRがクロマチンに集積し、さらに様々な因子依存的にATRが活性化される。しかし、その分子機構はいまだに十分理解されていない。我々は、ATRの必須会合分子であるATRIP分子がクロマチンに集積するために、ファンコニ貧血コア複合体成分が重要であることを見出した。この成果を論文投稿中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ChIP法による検討を行うための細胞と抗体の準備は遅れているが、その他の研究項目については、順調に複合体の精製、成分の同定などが進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
遺伝子の自由な改変が可能なことがニワトリDT40細胞の最大の利点であり、fragile siteの検討をDT40細胞で行う予定であったが、少なくとも顕微鏡下で染色体断裂を観察する方法では不可能と思われる。今後は、ヒト細胞に系をうつし、新規ゲノム編集技術TALENを導入することで、DT40と同様の利点をヒト細胞の検討において実現できるよう検討していく。
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[Journal Article] ATR-Chk1 signaling pathway and homologous recombinational repair protect cells from 5-fluorouracil cytotoxicity2012
Author(s)
Fujinaka Y, Matsuoka K, Iimori M, Tuul M, Sakasai R, Yoshinaga K, Saeki H, Morita M, Kakeji Y, Gillespie DA, Yamamoto KI, Takata M, Kitao H, Maehara Y
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Journal Title
DNA Repair (Amst)
Volume: 11
Pages: 247-58
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] ATR-ATRIP kinase complex triggers activation of the Fanconi anemia DNA repair pathway2012
Author(s)
Shigechi T, Tomida J, Sato K, Kobayashi M, Eykelenboom JK, Pessina F, Zhang Y, Uchida E, Ishiai M, Lowndes NF, Yamamoto K, Kurumizaka H, Maehara Y, Takata M
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Journal Title
Cancer Res
Volume: 72
Pages: 1149-1156
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Predisposition to cancer caused by genetic and functional defects of Mammalian atad52011
Author(s)
Bell DW, Sikdar N, Lee KY, Price JC, Chatterjee R, Park HD, Fox J, Ishiai M, Rudd ML, Pollock LM, Fogoros SK, Mohamed H, Hanigan CL; NISC Comparative Sequencing Program, Zhang S, Cruz P, Renaud G, Hansen NF, Cherukuri PF, Borate B, McManus KJ, Stoepel J, Sipahimalani P, Godwin AK, Sgroi DC, Merino MJ, Elliot G, Elkahloun A, Vinson C, Takata M, Mullikin JC, Wolfsberg TG, Hieter P, Lim DS, Myung K
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Journal Title
PLoS Genet
Volume: 7
Pages: e1002245
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] 放射線被曝医療2011
Author(s)
高田穣
Organizer
第28回日本医学会総会講演会特別企画プログラム
Place of Presentation
東京ビッグサイト(東京都)(招待講演)
Year and Date
2011-09-17
