複製フォークの安定化機構とその破綻による病態の解析

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Functions of non-coding DNA region for genome integrity
• Project/Area Number: 23114010
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 高田 穣 京都大学, 放射線生物研究センター, 教授 (30281728)
• Project Period (FY): 2011-07-25 – 2016-03-31
• Keywords: 複製フォーク / ゲノム安定性 / チェックポイント / 染色体脆弱部位 / 複製ストレス / ファンコニ貧血

Research Abstract

１）染色体ストレス高感受性部位の網羅的解析：染色体ストレス下におけるDNA損傷応答タンパク質のクロマチン集積を指標に、ストレス高感受性部位を同定し、その性状を解析する。新規のゲノム編集酵素であるTALENを用いてヒト細胞のFANCD2遺伝子C末領域に３ｘFLAGタグをノックインすることに成功した。今年度は、ChIP条件の検討をほぼ完了したので、来年度は太田班との連携でChIP-seq法を実施し、非コードDNA領域との関連に着目しつつ、ストレス高感受性部位をゲノムワイドに同定することを試みる。
２）複合体プロテオミクスによる複製フォーク安定化と崩壊機構の解析： ATRIP、FANCL、FANCD2、FANCIの複合体精製により同定された因子のうち、FANCD2に会合するCtIPを中心に解析した。CtIPはFAND2依存的に損傷局所に集積し、DNA二重鎖切断の末端においてend resectionに機能することがわかった。これらの結果は、CtIPがFANCD2の機能的エフェクターとして複製フォーク安定化に寄与することを意味している。
３）染色体ストレス下のチェックポイントキナーゼATRIP-ATR初期活性化機構の解析：ATRIP因子のクロマチン集積にファンコニ貧血コア複合体成分が重要な役割を果たすことを見出した。ATRIPとFANCLは会合することが判明し、ATRIPとRPAの結合を安定化する。これらの成果をまとめ論文発表した(Nucleic Acids Res. 41(14):6930-6941 (2013))。
４）領域内の他班との連携：ChIP-seqは太田班との連携研究である。小林班の同定した酵母においてrDNA安定性に重要な因子の高等生物における機能にを明らかにするためRPL27A分子のノックアウト細胞構築を行った。また、桝本班とは、CENP-AシャペロンHjurpのDNA損傷と複製ストレスにおける役割について検討中である。特に、Hjurpの損傷局所への集積と、各種因子との直接会合を検討した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

おおむね順調に成果を得ており、論文も出版することができている。中間評価でもその旨のコメントをいただいた。しかし、一部の実験でやや遅れが出ている。特に、ChIP-seq法の実施において、いろいろ検討事項が多く、期待したスピードで進行することが出来ていないのは事実である。それも検討はほぼ完了したので、来年度はいよいよ次世代シーケンサーにかける段階となっている。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究推進に、研究室に配置されるあらたな人員を投入し、siRNAによるスクリーニングを行いたい。これは従来行っていないストラテジーであり、当施設に設置されたIn Cell Analyzerと組み合わせることで、多数の因子の複製フォーク維持における機能を迅速に検討可能となることが期待できる。また、新規にDT40細胞におけるジーンターゲティングを行い、遺伝子ノックアウト細胞を樹立し、新知見を得ることを目指す。

Research Products

• [Journal Article] A novel interplay between the Fanconi anemia core complex and ATR-ATRIP kinase during DNA cross-link repair. (2013)
  • Author(s): Tomida J, Itaya A, Shigechi T, Unno J, Uchida E, Ikura M, Masuda Y, Matsuda S, Adachi J, Kobayashi M, Meetei AR, Maehara Y, Yamamoto KI, Kamiya K, Matsuura A, Matsuda T, Ikura T, Ishiai M, Takata M.
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. Volume: 41 Pages: 6930-6941
  • DOI: 10.1093/nar/gkt467
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Variant ALDH2 is associated with accelerated progression of bone marrow failure in Japanese Fanconi anemia patients. (2013)
  • Author(s): Hira A, Yabe H, Yoshida K, Okuno Y, Shiraishi Y, Chiba K, Tanaka H, Miyano S, Nakamura J, Kojima S, Ogawa S, Matsuo K, Takata M, Yabe M
  • Journal Title: Blood Volume: 122 Pages: 3206-9
  • DOI: 10.1182/blood-2013-06-507962
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Tumor suppressor RecQL5 controls recombination induced by DNA crosslinking agents. (2013)
  • Author(s): Hosono Y, Abe T, Ishiai M, Islam MN, Arakawa H, Wang W, Takeda S, Ishii Y, Takata M, Seki M, Enomoto T.
  • Journal Title: Biochim Biophys Acta. Volume: 1843 Pages: 1002-1012
  • DOI: 10.1016/j.bbamcr.2014.01.005
  • Peer Reviewed
• [Presentation] FANCD2 in chromatin anchors CtIP and regulates DNA end resection during crosslink repair (2013)
  • Author(s): J. Unno, A. Itaya, M. Taoka, K. Sato, J. Tomida, W. Sakai, T. Ikura, T. Isobe, H. Kurumizaka, M. Takata
  • Organizer: 25th Annual Fanconi anemia research fund Scientific Symposium
  • Place of Presentation: Houston, Texas, USA
  • Year and Date: 20131024-20131027
• [Presentation] ファンコニ貧血とＤＮＡクロスリンク修復の分子機構 ー最近の進歩ー (2013)
  • Author(s): 高田 穣
  • Organizer: 日本血液学会
  • Place of Presentation: 札幌市
  • Year and Date: 20131011-20131013
  • Invited
• [Presentation] Fanconi貧血とゲノム不安定性
  • Author(s): 高田 穣
  • Organizer: 第13回血液フォーラム21 －造血不全－
  • Place of Presentation: 東京フォーラム
  • Invited