2013 Fiscal Year Annual Research Report
メチオニン代謝回路とエピゲノムの共役機構とそのがん化への関与
| Project Area | Crosstalk of transcriptional control and energy pathways by hub metabolites |
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| Project/Area Number |
23116003
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
五十嵐 和彦 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00250738)
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| Project Period (FY) |
2011-07-25 – 2016-03-31
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| Keywords | 発現制御 / 発生・分化 / プロテオーム / マイクロアレイ / 免疫学 |
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| Research Abstract |
今年度は特記すべき成果として以下の結果を得た。MATIIaおよびbについて、種間の保存性や既知ドメインを参考に多数の欠失変異体を作成し、293T細胞やHela細胞などで細胞内分布を比較した。まず、予想外な知見として、αとβはそれぞれ単独で過剰発現した場合、全く異なる細胞内分布を示すことを見いだした。αは主に細胞質に分布するのに対して、βはほとんどの細胞で核に局在した。両者を同時に発現させると、αも核に局在する細胞が著しく増加した。α単独で発現した場合には上述のごとく細胞質に主に分布するが、一部（約10%程度）の細胞では細胞質+核の分布を示したことから、これを指標にαの欠失変異の分布を比較した。そして、αのC末端7アミノ酸の領域が核分布に必須であることを見いだした。以上の結果から、βはαの核移行を制御する調節サブユニットであること、そしてαのC末端領域と結合することにより核への分布を調節することが考えられた。αとβがヘテロオリゴマーとして分布する細胞内部位を特定することをsplit venus系を応用して進めた。この系では蛍光蛋白質Venusが二つに分断され、それぞれを相互作用を調べたいタンパク質に融合して発現させる。相互作用が細胞内で生じた場合にはVenusが再構成され、相互作用形成部位にて蛍光が観察される。この系をαおよびβの細胞内オリゴマー形成の解析に用いた。α全長を改良Venus系で調べると、αは細胞内でホモオリゴマーを形成すること、これは主に細胞質に分布することがわかった。一方、βのホモオリゴマーは検出されなかった。αとβの相互作用は改良Venus系でも確認され、さらに、このヘテロオリゴマーは主に核に分布することがわかった。以上の結果から、βサブユニットの機能がMATIIの核移行にあることが結論できた。現在、共同研究論文を執筆しており、近々投稿予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上述のようにSAM合成酵素を核へ局在化させる制御システムを特定することができた。これは、SAM合成が核の中で行われることという我々の「SAMの地産地消モデル」を強力に支持する結果であり、大きな成果と考えている。また、このほかにもSAM合成酵素に関して多くの知見を得ている。例えば、形質細胞株X63/0にエピトープ・ビオチン化配列付加MATIIαを発現させ、不安定な相互作用や一過性の相互作用も検出することを目指し、ReClip法（可逆的な化学架橋法）を導入し、精製および質量分析を実施した。精製は可溶性分画およびクロマチン分画からそれぞれ行った。計3回の精製と質量分析を行い、モック（陰性対照）との差および再現性を確認できたMATIIα相互作用因子のリストを作成した。予想通り、リンパ球系で重要な転写因子が検出されたことから、MATIIαはその標的遺伝子の制御にも関わることが予想される。また、クロマチンリモデリング因子やメチル化酵素なども多数見いだすことができた。さらに、MATIIαおよびβがヒストンメチル化酵素SetDB1と複合体を形成し、標的遺伝子特異的なヒストンH3 K9メチル化に関わることを示し、論文として発表した（Kera Y. et al., J. Biol. Chem. 2013）。一方、26年度から取りあげる鉄代謝と遺伝子発現の関係についても、ヘム受容体でもある転写因子Bach1の解析を中心として、鉄欠乏に対する遺伝子発現応答機構という本質的問題に迫る知見を得ることができた。この研究成果はCold Spring Harbor Laboratory Meetingの口頭発表にも採択されるなど、大きな注目を集めつつある。このような点から、着実に研究が進展していると判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
MATIIα C末端領域の点変異体シリーズを作成し、そのβとの相互作用および細胞内局在を比較する。細胞内局在や免疫共沈降を指標に、受容体リガンドや酵素阻害剤等を用いてαとβの相互作用を促進したり逆に阻害する細胞内シグナル系を探索する。肝癌細胞におけるMATIIαのChIP-Seqを実施する。周辺のシスエレメント解析を行い、MATIIαと協同する転写因子候補を得る。特に、新たにMATIIとの結合を見いだした転写因子にも注目してデータ解析を進める。MATIIは単一の複合体としてではなく、相互作用因子を時と場合によって変えることが考えられる。そこで、形質細胞分化系と免疫沈降法を用いて、分化過程にそって相互作用因子のMATIIα結合が変化するかどうかを調べる。MATIIα相互作用因子の中から、形質細胞分化に限らず、より広く様々な生物種で細胞応答に関係する因子に着目し、それら因子とMATIIホモログとの遺伝的相互作用を、領域代表深水らとの共同研究として線虫を用いて検討する。αのC末端領域に点変異を導入し、βとの相互作用を壊すものを特定する。この点変異を導入した遺伝子置換マウスの作製を進める。平成26年度にはマウスの作製を終える。Bach1およびBach2はいずれもヘム受容体でもあり、ノックアウトマウスの解析からそれぞれ鉄欠乏への適応に必須であることを見いだした（論文投稿準備中）。鉄減少がヘム量減少を引き起こし、その結果Bachが活性化され（Bachはヘムにより阻害される）、遺伝子発現を変えることにより鉄欠乏への適応を引き起こすことが考えられる。そこで、この経路における標的遺伝子（鉄代謝関連遺伝子を想定）を同定する。細胞としては赤血球および鉄再利用の中心であるマクロファージを対象に、Bach1およびBach2ノックアウトマウス由来の細胞を用いてRNA発現プロファイリングを行う。
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[Journal Article] Heme-Mediated SPI-C Induction Promotes Monocyte Differentiation into Iron-Recycling Macrophages.2014
Author(s)
Haldar, M., Kohyama, M., So, A.Y., Kc, W., Wu, X., Briseno, C.G., Satpathy, A.T., Kretzer, N.M., Arase, H., Rajasekaran, N.S., Wang, L., Egawa, T., Igarashi, K., Baltimore, D., Murphy, T.L., and Murphy, K.M.
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Journal Title
Cell
Volume: 156
Pages: 1223-1234
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Association between BACH2 expression and clinical prognosis in diffuse large B-cell lymphoma.2014
Author(s)
Ichikawa, S., Fukuhara, N., Katsushima, H., Takahashi, T., Yamamoto, J., Yokoyama, H., Sasaki, O., Fukuhara, O., Nomura, J., Ishizawa, K., Ichinohasama, R., Muto, A., Igarashi, K., and Harigae, H.
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Journal Title
Cancer Science
Volume: in press
Pages: in press
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Bach1 is critical for the transformation of mouse embryonic fibroblasts by Ras(V12) and maintains ERK signaling.2013
Author(s)
Nakanome, A., Brydun, A., Matsumoto, M., Ota, K., Funayama, R., Nakayama, K., Ono, M., Shiga, K., Kobayashi, T., and Igarashi, K.
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Journal Title
Oncogene
Volume: 32
Pages: 3231-3245
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Methionine adenosyltransferase II-dependent histone H3K9 methylation at the COX-2 gene locus.2013
Author(s)
Kera, Y., Katoh, Y., Ohta, M., Matsumoto, M., Takano-Yamamoto, T. and Igarashi, K.
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Journal Title
The Journal of Biological Chemistry
Volume: 288
Pages: 12592-13601
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Bach2 represses effector programmes to stabilize Treg-mediated immune homeostasis.2013
Author(s)
Roychoudhuri, R., Hirahara, K., Mousavi, K., Clever, D., Klebanoff, C. A., Bonelli, M., Sciume, G., Zare, H., Vahedi, G., Dema, B., Yu, Z., Liu, H., Takahashi, H., Rao, M., Muranski, P., Crompton, J. G., Punkosdy, G., Muto, A., Igarashi, K., et al.
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Journal Title
Nature
Volume: 498
Pages: 506-510
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] BACH2 mediates negative selection and p53-dependent tumor suppression at the pre-B cell receptor checkpoint.2013
Author(s)
Swaminathan, S., Huang, C., Geng, H., Chen, Z., Harvey, R., Kang, H., Ng, C., Titz, B., Hurtz, C., Sadiyah, M. F., Nowak, D., Thoennissen, G. B., Rand, V., Graeber, T. G., Koeffler, H. P., Carrooll, W. L. Willman, C. L., Hall, A. G., Igarashi, K., Melnick, A. and Muschen, M.
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Journal Title
Nature Medicine
Volume: 19
Pages: 1014-1022
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Bach2 maintains T cells in a naïve state by suppressing effector memory-related genes.2013
Author(s)
Tsukumo, S., Unno, M., Muto, A., Takeuchi, A., Kometani, K., Kurosaki, T., Igarashi, K. and Saito, T.
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Journal Title
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
Volume: 110
Pages: 10735-10740
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Transforming Growth Factor-β Induces transcription factors MafK and Bach1 to Suppress Expression of the Heme Oxygenase-1 Gene.2013
Author(s)
Okita, Y., Kamoshida, A., Suzuki, H., Itoh, K., Motohashi, H., Igarashi, K., Yamamoto, M., Ogami, T., Koinuma, D., and Kato, M.
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Journal Title
The Journal of Biological Chemistry
Volume: 288
Pages: 20658-20677
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] The transcription repressor Bach2 is required for pulmonary surfactant homeostasis and alveolar macrophage function.2013
Author(s)
Nakamura, A., Shibuya, R. E., Itoh-Nakadai, A., Muto, A., Shima, H., Saigusa, D., Aoki, J., Ebina, M., Nukiwa, T. and Igarashi, K.
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Journal Title
The Journal of Experimental Medicine
Volume: 210
Pages: 2191-2204
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites containing DNA damage.2013
Author(s)
Shima, H., Suzuki, H., Sun, J., Kono, K., Shi, L., Kinomura, A., Horikoshi, Y., Ikura, T., Ikura, M., Kanaar, R., Igarashi, K., Saitoh, H., Kurumizaka, H., and Tashiro S.
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Journal Title
Journal of Cell Science
Volume: 126
Pages: 5284-5292
DOI
Peer Reviewed
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