2014 Fiscal Year Annual Research Report
ゲノム配列情報とエピゲノム情報の維持・変異のクロスレギュレーション
| Project Area | Crosstalk of transcriptional control and energy pathways by hub metabolites |
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| Project/Area Number |
23116008
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
菅澤 薫 神戸大学, 自然科学系先端融合研究環バイオシグナル研究センター, 教授 (70202124)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 遺伝子 / エピゲノム / 発現制御 / DNA損傷修復 / 変異 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．DNA損傷修復制御におけるエピゲノム環境の役割
昨年度までに、ヌクレオチド除去修復（NER）におけるDNA損傷認識因子XPCやDDB2の損傷部位へのリクルートにヘテロクロマチン様の構造が関与する可能性が示唆された。今年度は、ヒストンアセチル化酵素阻害剤だけでなく、H3K9トリメチル化に関わるSUV39H1の発現抑制がXPCの損傷部位へのリクルートの遅延や、DNA修復速度の低下を引き起こすことを見出すとともに、ヘテロクロマチンタンパク質HP1とXPCが共局在すること、HP1自身がXPCやDDB2に依存せずにDNA損傷部位にリクルートされることを明らかにした。一方、XPCがDDB2の紫外線誘導性分解を負に制御することで、紫外線誘発DNA損傷の認識と修復活性の持続に寄与していることを見出すとともに、DDB2相互作用因子の探索により、細胞内代謝に関与するアポトーシス誘導因子やクロマチンリモデリング因子を新たに同定した。
２．エピゲノム制御におけるDNA修復機構の役割
能動的DNA脱メチル化への関与が示唆されている塩基除去修復酵素チミンDNAグリコシラーゼ（TDG）を欠損したマウス胎仔線維芽細胞（Tdg-/- MEF）を親株として、野生型および種々の変異型TDGを安定発現する細胞株を樹立した。特にPCNAとの相互作用に関わるPIP degron motifに変異を導入したTDGが他に比べて高い発現レベルを示したことから、昨年度までに同定したTDG分解に関与するユビキチンリガーゼの役割が改めて確認された。これらの細胞株を用いてゲノムDNAにおける5-mC、5-hmCの定量を行うとともに、iPS細胞への誘導を行ってTDG変異の影響を調べる実験を進めている。また、DNAやRNAの内因性メチル化損傷の修復に関わるALKBH3過剰発現細胞でポリアミン合成経路が亢進していること、この細胞がポリアミン合成阻害剤に対して高感受性を示すことを新たに見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．DNA損傷修復制御におけるエピゲノム環境の役割
昨年度までに、ヘテロクロマチン様構造の形成がNERに関与する可能性が示唆されたが、ヒストンの脱アセチル化に加えて、ヒストンのメチル化やHP1の関与が示されたことでさらにモデルが補強された。特にXPCやDDB2に依存せずにHP1が局所紫外線照射部位にリクルートされるという知見は、損傷部位において何らかのメカニズムでまず自発的なクロマチン構造の変化が起こり、その後の損傷認識因子のリクルートを助けている可能性を示唆するもので非常に興味深い。一方、NERの活性制御において重要な役割を担うXPCとDDB2の機能的相互作用を明らかにするとともに、DDB2複合体構成成分の解析から細胞内代謝や転写制御に関わる興味深い因子が得られている。このように、この部分の研究は順調に進んでいる。
２．エピゲノム制御におけるDNA修復機構の役割
Tdg-/- MEFを親株とする変異TDG発現細胞を樹立し、昨年度までに同定したTDG分解に関わるユビキチンリガーゼの役割を確認することができた。これらの細胞におけるDNAメチル化状態の解析は技術的な問題で遅れていたが、LC-MSによる解析を導入することで問題は克服されつつある。一方、ALKBH3過剰発現細胞が増殖速度の有意な上昇に加えて、ポリアミン合成経路の亢進という興味深い表現型が得られており、これがメチル化DNA/RNAの修復活性とどのように関連するかを明らかにすることが今後の課題である。この部分の研究全体としては、当初計画に比べて多少の遅れがあるものの、一定の成果が得られているものと考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．DNA損傷修復制御におけるエピゲノム環境の役割
ヘテロクロマチン様構造の形成とNERとの関係をさらに詳しく理解するため、ヒストン脱アセチル化酵素やDNAメチル化酵素などを対象に、局所紫外線照射部位に集積する因子を同定してそのNERにおける機能を明らかにする。またXPCやDDB2とヘテロクロマチンとの共局在を超解像顕微鏡によって観察すると共に、ヒストン修飾等のヘテロクロマチンマーカーとXPC、DDB2のゲノムワイドな分布の比較をChIP-seq解析により行う予定である。またDDB2相互作用因子の機能解析を進め、DNA損傷認識と細胞内代謝および転写制御とのクロストークを明らかにする。
２．エピゲノム制御におけるDNA修復機能の役割
Tdg-/- MEFを親株とする変異TDG安定発現細胞を用いて、LC-MSによるDNAメチル化状態の解析を進めると共に、iPS細胞の作製およびその分化誘導実験を行って、エピジェネティックなリプログラミング過程におけるTDGの役割を明らかにする。ALKBH3の解析については、種々の変異体を作製することでDNA/RNA脱メチル化修復酵素としての機能と、細胞増殖、代謝における表現型との関係を明らかにする。
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[Journal Article] Functional regulation of the DNA damage-recognition factor DDB2 by ubiquitination and interaction with xeroderma pigmentosum group C protein.2015
Author(s)
Matsumoto, S., Fischer, E.S., Yasuda, T., Dohmae, N., Iwai, S., Mori, T., Nishi, R., Yoshino, K., Sakai, W., Hanaoka, F., Thoma, N.H., Sugasawa, K.
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Journal Title
Nucleic Acids Research
Volume: 43
Pages: 1700-1713
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] SUMO-modification and elimination of the active DNA demethylation enzyme TDG in cultured human cells.2014
Author(s)
Moriyama, T., Fujimitsu, Y., Yoshikai, Y., Sasano, T., Yamada, K., Murakami, M., Urano, T., Sugasawa, K. and Saitoh, H.
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Journal Title
Biochemical and Biophysical Research Communications
Volume: 447
Pages: 419-424
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Human mediator MED17 subunit plays essential roles in gene regulation by associating with the transcription and DNA repair machineries.2014
Author(s)
Kikuchi, Y., Umemura, H., Nishitani, S., Iida, S., Fukasawa, R., Hayashi, H., Hirose, Y., Tanaka, A., Sugasawa, K. and Ohkuma, Y.
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Journal Title
Genes to Cells
Volume: 20
Pages: 191-202
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Functional regulation of thymine DNA glycosylase involved in DNA repair and epigenetic reprogramming.2014
Author(s)
Nakamura, T., Murakami, K., Uehara, Y., Ono, T., Urano, T., Nishitani, H. and Sugasawa, K.
Organizer
The 9th 3R Symposium
Place of Presentation
御殿場高原ホテル
Year and Date
2014-11-17 – 2014-11-21
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