2014 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Synthetic biology for the comprehension of biomolecular networks |
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| Project/Area Number |
23119004
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
柘植 謙爾 慶應義塾大学, 政策・メディア研究科, 特任講師 (70399690)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ゲノムデザイン / 合成生物学 / 遺伝子発現制御 / 人工オペロン / 遺伝子集積 / バクテリア / 代謝経路 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成２６年度も引き続き、多要素が関与する代謝経路として色素性物質の「カロテノイド」、「アントシアニン」の２つの代謝経路を取り上げ、以下の研究を行った。
「カロテノイド」 グルコースからカロテノイドの一連の代謝経路に関わる遺伝子は約３０個程度存在するが、これらのうち「カロテノイド合成経路」遺伝子５個を除く、一次代謝経路遺伝子群を「解糖系」、「メバロン酸・非メバロン酸経路」、「アセチルCoA生産経路」と、代謝経路ごとに分割し、それぞれ大腸菌遺伝子を集積した人工オペロンについては平成２５年度までに構築している。平成２６年度は、これらのオペロンを、代謝経路ごとに真核生物である出芽酵母遺伝子を用いた人工オペロンに交換することを行った。その結果、「カロテノイド代謝経路」を除くすべての人工オペロンについて、酵母遺伝子に交換したオペロンの構築に成功した。これらを全て連結することで、グルコースからカロテノイドまでの一連の代謝経路の全てが大腸菌以外の外来の遺伝子からなる人工カロテノイドゲノムを構築し、これをゲノム中の「解糖系」、「非メバロン酸経路」、「アセチルCoA生産経路」の遺伝子を全て欠損した大腸菌に導入することに成功した。
「アントシアニン」 平成２５年度までに構築したF3H、 DFR、 LDOXの3酵素遺伝子を連結した「３遺伝子ペラルゴニジンオペロン」をプラスミドの形で有する大腸菌を、本オペロンに対して出発材料となるナリンゲニンを添加した培地での培養において、その培養の種類を検討した結果、培地の変更により元のLB培地に比較して60倍のペラルゴニジンの高生産を実現し、菌体ペレットをペラルゴニジンの蓄積により赤く着色することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「カロテノイド」 すべての代謝経路において大腸菌遺伝子による人工オペロンとともに、出芽酵母の遺伝子からなる酵母遺伝子オペロンを構築し、かつ、酵母遺伝子オペロンのみを連結した人工カロテノイドゲノムの構築に成功した点は、大きな進展である。しかしながら、本ゲノムの最大の特徴となるはずの、グルコースを唯一の炭素源とした培地で生育しカロテノイドを生産することについては、まだ実現できていない。これは、作成したオペロン内の外来遺伝子の発現量のチューンアップがまだ不十分のためだと考えている。しかしながら、研究代表者の開発した遺伝子集積法のOGAB法を用いることで、様々な配列の人工オペロンを構築することが可能であるので、これを用いることで最終年度中に遺伝子発現のチューンアップは可能であると考えている。
「アントシアニン」 ナリンゲニンを出発材料に、構築したペラルゴニジン人工オペロンにより、菌体ペレットの着色に成功した点は、大きな成果である。一方、このオペロンをチロシンからナリンゲニンまで生合成する「ナリンゲニンオペロン」の後につないだ全長7酵素遺伝子から構成される「７遺伝子ペラルゴニジンオペロン」でペラルゴニジンの生合成を試みたが、蓄積は確認できなかった。「７遺伝子ペラルゴニジンオペロン」を有する大腸菌は、中間代謝産物のナリンゲニンを培地中に加えても、前述の「３遺伝子ペラルゴニジンオペロン」程度にはペラルゴニジンを生産しなかったことから、ナリンゲニン以降の代謝に関わる酵素遺伝子は、より高発現が必要であることが判明した。最終年度中にこれらの問題点は十分に解消できるものと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２６年度より引き続き、（１）カロテノイド、（２）アントシアニンという２種類の色素生合成経路の人工遺伝子代謝経路の構築を目標に、最終年度である平成２７年度は以下のように行う予定である。
「カロテノイド」 平成２６年度までに、大腸菌のグルコースからカロテノイドまでの一連の代謝経路を、主に真核生物である出芽酵母の遺伝子を用いた人工オペロン（酵母遺伝子人工オペロン）により実行する株の構築に成功したが、本オペロンは大腸菌の遺伝子を用いた同様の人工オペロンに比べ増殖速度が遅いため、その後の遺伝子操作が困難であり、まだ機能的に不十分である。そこで、酵母遺伝子人工オペロン内のプロモーターの種類や遺伝子連結順序を変更することで遺伝子発現量を適切に調節した新たなオペロンを構築することで、増殖速度とカロテノイド生産量の改善を行う。次に、A01花井班の作成した培養フェーズに応答して働く遺伝子スイッチを作成した外来遺伝子人工オペロンのプロモーターとして利用することにより、培養フェーズ特異的なカロテノイド生産が可能かどうかを検討する。また、これらの人工オペロンを、枯草菌に導入し物質生産することにより、人工オペロンが大腸菌以外の生物でも機能するかどうかを検証する。
「アントシアニン」 平成２６年度までに作成した、アントシアニン生合成経路の中間代謝産物であるナリンゲニン以降の反応に必要な３酵素遺伝子を連結した「３遺伝子ペラルゴニジンオペロン」と、チロシンもしくはフェニルアラニンからナリンゲニンまでの生合成までに関わる「ナリンゲニンオペロン」の各遺伝子の発現量を厳密に調製するべく、各人工オペロンのプロモーターの選択、遺伝子連結順序の変更を行い、生産量を増大させる因子の組み合わせを検討し、大腸菌コロニーの着色を目指す。
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