生体酵素系に生成する感応性化学種の同定と機能解明

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Stimuli-responsive Chemical Species for the Creation of Functional Molecules
• Project/Area Number: 24109017
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 井上 豪 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20263204)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中村 努 独立行政法人産業技術総合研究所, その他部局等, 研究員 (10357668) ; 松村 浩由 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (30324809)
• Project Period (FY): 2012-06-28 – 2017-03-31
• Keywords: 蛋白質 / X線

Research Abstract

超好熱性古細菌A. pernix K1由来ペルオキシレドキシン(ApPrx)やA. pernix K1由来の金属酵素スーパーオキシドディスムターゼ(ApeSOD)の反応中間体の中性子線構造解析や、低温トラップ法による時分割X線構造解析により詳細な反応機構の解明を目指す。中 性子構造解析のための結晶化には1 mm角を超える高品質結晶が必要であり、24年度に続きこれら酵素の大量精製、ミクロ種結晶化法、マクロ種結晶化法を駆使した種結晶化を繰り返し、大型結 晶育成のための結晶化実験に取り組んた。しかし、いずれも多結晶化のため中性子線回折実験には至っていない。一方、時分割構造解析の 可能性を秘めたSACLAのX線自由電子レーザーを用いたX線構造解析（文科省重点戦略研究課題【代表：岩田想】との共同研究）を進 め、チロシナーゼ、Mb、FABP3、NIRの結晶構造を解析した。その結果、MbのFeイ オンの酸化によるヘムの構造変化や、NIRの世界初の完全酸化型構造を観察するなどの成果が得られ、上記2つの標的酵素の反応中間体の構造解析の可 能性について検討することができた。また、エキシマ発光で構造変化が検出可能なピレン修飾アデニル酸キナーゼの構造基盤を構築するために、本修飾酵素の構造解析を行 い、Py-Adk内での修飾ピレンのエキシマ形成の様子が 原子レベルで明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

申請当初の計画通り、専属の研究員を採用し、ApeSODの構造解析など研究はおおむね順調に進展していると考えている。ただし、大型の高品 質結晶の育成では多結晶化の問題で困難を極め、引き続き新たな蛋白質のコンストラクトの作成や大型結晶育成技術の構築を進める一方で、 SACLAの利用や他の酵素での反応中間体の構造解析を進め、順調にデータが得られている。

Strategy for Future Research Activity

大型結晶育成が困難で中間体で存在すると思われる水素原子の確認は現時点では困難を極めているが、通常のX線で自由電子レーザーを用いれば反 応中間体の構造を解析できる可能性を見出している。SACLAは現在のところビームタイムの制限が大きいものの、反応中間体の構造解析を可能 とする夢の光であり、今後、溶液中で過酸化水素と反応させた中間体のX線構造解析をSACLAで展開するなどの方法で構造解析を試みたいと考 えている。

Research Products

• [Journal Article] Jumonji/Arid1b (Jarid1b) protein modulates human esophageal cancer cell growth (2013)
  • Author(s): Y. Kano, M Konno, K. Ohta, N. Haraguchi, S. Nishikawa, Y. Kagawa, A. Hamabe, S. Hasegawa, H. Ogawa, T. Fukusumi, Y. Noguchi, M. Ozaki, T. Kudo, D. Sakai, T. Satoh, M. Ishii, E. Mizohata, T. Inoue, M. Mori, Y. Doki, H. Ishii,
  • Journal Title: Molecular and Clinical Oncology Volume: 1 Pages: 753-757
  • DOI: 10.3892/mco.2013.127
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Fabrication of poly(γ-glutamic acid) monolith by thermally induced phase separation and its application (2013)
  • Author(s): S. B. Park, T Fujimoto, E Mizohata, T Inoue, M.- H. Sung, and H. Uyama
  • Journal Title: J. Microbiol. Biotechnol. 23 Volume: 23 Pages: 942-952
  • DOI: 10.1016/j.polymdegradstab.2013.11.019
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structure of peroxiredoxin from anaerobic hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii (2013)
  • Author(s): T. Nakamura*, A. Mori, M. Niiyama, H. Matsumura, C. Tokuyama, J. Morita, K. Uegaki and T. Inoue
  • Journal Title: Acta. Cryst. Volume: F69 Pages: 719-722
  • DOI: 10.1107/S1744309113014036
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of spermidine acetyltransferase from Escherichia coli (2013)
  • Author(s): M. Niiyama, S. Sugiyama, M. Hirose, S. Ishikawa, H. Tomitori, K. Higashi, T. Yamashita, H. Adachi, K. Takano, S. Murakami, M. Murata, T. Inoue, Y. Mori, K. Kashiwagi, H. Matsumura, and K. Igarashi
  • Journal Title: Acta. Cryst. Volume: F69 Pages: 884-887
  • DOI: 10.1107/S1744309113017132
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic study of FtsA from methicillin-resistant Staphylococcus aureus (2013)
  • Author(s): J. Fujita, Y. Miyazaki, M. Hirose, C. Nagao, E. Mizohata, Y. Matsumoto, K. Mizuguchi, T. Inoue, and H. Matsumura
  • Journal Title: Acta. Cryst. Volume: F69 Pages: 895-898
  • DOI: 10.1107/S1744309113017727
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Targeting BIG3-PHB2 interaction to overcome tamoxifen resistance in breast cancer cells (2013)
  • Author(s): T. Yoshimaru, M. Komatsu, T. Matsuo, Y.-A. Chen, Y. Murakami, K. Mizuguchi, E. Mizohata, T. Inoue, M. Akiyama, R. Yamaguchi, S. Imoto, S. Miyano, Y. Miyoshi, M. Sasa, Y. Nakamura, and T. Katagiri
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 4 Pages: 2433
  • DOI: 10.1038/ncomms3443
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Construction and characterization of functional anti-epiregulin humanized monoclonal antibodies (2013)
  • Author(s): Y.-H. Lee, M. Iijima, Y. Kado, T. Inoue, A. Sugiyama, H. Doi, Y. Shibasaki, T. Kodama
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun Volume: 441 Pages: 1011-1017
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.11.014
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structure of the human-heart fatty-acid-binding protein 3 in complex with the fluorescent probe 1-anilinonaphthalene-8-sulphonic acid (2013)
  • Author(s): M. Hirose, S. Sugiyama, M. Niiyama, D. Matsuoka, T. Hara, E. Mizohata, S. Murakami, T. Inoue, S. Matsuoka, and M. Murata
  • Journal Title: 10.1107/S0909049513021298 Volume: 20 Pages: 923-928
  • DOI: J. Synchrotron Radiat.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] C(sp(3))-H Bond Hydroxylation Catalyzed by Myoglobin Reconstituted with Manganese Porphycene (2013)
  • Author(s): K. Oohora, Y.i Kihira, E. Mizohata, T. Inoue and T. Hayash
  • Journal Title: J. Am. Chem. Soc. Volume: 135 Pages: 17282-17285
  • DOI: 10.1021/ja409404k.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural insights into the function of a thermostable copper-containing nitrite reductase (2013)
  • Author(s): Y. Fukuda, K. Tse, E. Mizohata, H. Matsumura, H. Takami, M. Nojiri, T. Inoue
  • Journal Title: J. Biochem. Volume: 155 Pages: 123-135
  • DOI: doi: 10.1093/jb/mvt107
  • Peer Reviewed