生体酵素系に生成する感応性化学種の同定と機能解明

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Stimuli-responsive Chemical Species for the Creation of Functional Molecules
• Project/Area Number: 24109017
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 井上 豪 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20263204)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中村 努 独立行政法人産業技術総合研究所, その他部局等, 研究員 (10357668) ; 松村 浩由 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (30324809)
• Project Period (FY): 2012-06-28 – 2017-03-31
• Keywords: 蛋白質 / X線

Outline of Annual Research Achievements

生体系では、酵素触媒反応の過程で一過的に感応性化学種が生成し、特異な機能を発揮することがある。本研究では、チオレドキシンペルオキシダーゼ中のチオール残基が過酸化水素と反応する際に生成する、超原子価硫黄原子を含むS-OH中間体の構造を中性子回折法でも直接観測し、その機能を解明するとともに、スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)で生成する一過的な金属配位構造も同定する。
平成26年度は、超好熱性古細菌A. pernix K1由来ペルオキシレドキシン(ApPrx)やA. pernix K1由来の金属酵素スーパーオキシドディスムターゼ(ApeS OD)の反応中間体の中性子線構造解析や、低温トラップ法による時分割X線構造解析により詳細な反応機構の解明を目指し、中性子構造解析のための1 mm角を超える高品質結晶の結晶化を試みたものの、いずれも多結晶化のため中性子線回折実験には至っていない。
一方、時分割構造解析の 可能性を秘めたSACLAのX線自由電子レーザーを用いたⅩ線構造解析（文科省重点戦略研究課題【代表：岩田想】との共同研究）も昨年度と同様に推進し、NIRの結晶構造解析を引き続き行い、昨年度成功していたアポ型のNIRの完全酸化型構造に加え、基質複合体のⅩ線構造解析を推進し、反応機構の解明が大きく進展した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

中性子構造解析のためには1 mm角を超える大型の高品質結晶が必要となるため、これまでApTPxを大量に精製し、ミクロ種結晶化法、マクロ種結晶化法を駆使した種結晶化を繰り返して大型結晶の育成を試みたが、いずれも多結晶化が進行し中性子構造解析が進行しなかった。そこで結晶のパッキングを変化させるMutation実験を試み、結晶形の異なるものを高品質化する方法を試みたが、結晶形が異なるようなMutantは得られていない。一方、これまでに解析したものとは由来の異なる、超好熱始原菌（Pyrococcus horikoshi）由来TPxについても大量精製、結晶化を行い、構造解析を行った。過酸化水素との反応中間体の構造を低温トラップ法で解析した結果、S-OH中間体ではないものの、これまでに観測された活性残基の大きな構造変化はApTPxと同様に観測することができ、種を超えて共通の反応メカニズムで過酸化水素の還元反応が進行している可能性が高まった。P. horikoshi由来のTPxについても大型結晶の調製を試みているが、中性子線解析に向く結晶は得られなかった。
一方、本新学術研究においては、種々の生体酵素系に生成する感応性化学種の同定と機能解明も目指して他の研究グループとの共同研究も積極的に行った。エキシマ発光で構造変化が検出可能なピレン修飾アデニル酸キナーゼの構造基盤の構築では、Py-Adk内での修飾ピレンのエキシマ形成の様子を原子レベルで明らかとし、論文化に至っている。また、SACLAのX線自由電子レーザー（文科省重点戦略研究課題【代表：岩田想】との共同研究）を積極的に取り入れ、チロシナーゼ、Mb、FABP3、NIRに加え、膜タンパク質であるバクテリオロドプシンのⅩ線に対する無損傷の構造解析を実現している。

Strategy for Future Research Activity

S-OH中間体の構造の証明には中性子線構造解析による硫黄原子上にある水素原子の直接観察が必須となる。引き続き、Mutation実験を行って結晶形の異なるApTPxの大型結晶化を目指すとともに、P. horikoshi由来TPxの大型結晶化を試み中性子構造解析を目指す。
一方、SACLAを利用したⅩ線構造解析は、常温で実施できることから反応中間体を時分割で解析できる唯一の手段であり魅力的である。ただし、時分割解析を可能とする装置の開発も同時に行う必要があり、ハードルは高い。しかし、感応性化学種の同定と、そのダイナミズムの解明にはSACLAを用いた中間体の構造解析が最も近道と考えられ、引き続き方法論の開発と同時に進める予定である。

Research Products

• [Journal Article] Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. (2015)
  • Author(s): Sugahara, M.; Mizohata, E.; Nango, E.; Suzuki, M.; Tanaka, T.; Masuda, T.; Tanaka, R.; Shimamura, T.; Tanaka, Y.; Suno, C.; Ihara, K.; Pan, D.; Kakinouchi, K.; Sugiyama, S.; Murata, M.; Inoue, T.; Tono, K.; Song, C.; Park, J.; Kameshima, T.; Hatsui, T.; Joti, Y.; Yabashi, M.; Iwata, S
  • Journal Title: Nature Methods, Volume: 12 Pages: 61-63
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structure-based design of a streptavidin mutant specific for an artificial biotin analogue. (2015)
  • Author(s): Kawato, T.; Mizohata, E.; Shimizu, Y.; Meshizuka, T.; Yamamoto, T. Takasu, N.; Matsuoka, M.; Matsumura, H.; Kodama, T.; Kanai, M.; Doi, H.; Inoue, T.; Sugiyama, A.
  • Journal Title: J. of Biochemistry Volume: 1 Pages: 1-9
  • DOI: 10.1093/jb/mvv004
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Crystal structure of streptavidin mutant with low immunogenicity. (2015)
  • Author(s): Kawato T, Mizohata E, Meshizuka T, Doi H, Kawamura T, Matsumura H, Yumura K, Tsumoto K, Kodama T, Inoue T & Sugiyama A.
  • Journal Title: J Biosci Bioeng. Volume: 119(6) Pages: 642-647
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2014.10.025.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structure-based design and synthesis of a bivalent iminobiotin analog showing strong affinity toward a low immunogenic streptavidin mutant. (2015)
  • Author(s): Kawato T, Mizohata E, Shimizu Y, Meshizuka T, Yamamoto T, Takasu N, Matsuoka M, Matsumura H, Kodama T, Kanai M, Doi H, Inoue T, Sugiyama A
  • Journal Title: Biosci Biotechnol Biochem. Volume: 79 Pages: 640-642
  • DOI: 10.1080/09168451.2014.991692.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structural features of interfacial tyrosine residue in ROBO1 fibronectin domain-antibody complex: Crystallographic, thermodynamic, and molecular dynamic analyses. (2014)
  • Author(s): Nakayama, T.; Mizohata, E.; Yamashita, T.; Nagatoishi, S.; Nakakido, M.; Iwanari, H.; Mochizuki, Y.; Kado, Y.; Yokota, Y.; Satoh, R.; Tsumoto, K.; Fujitani, H.; Kodama, T.; Hamakubo, T.; Inoue T
  • Journal Title: Protein Science, Volume: 24 Pages: 328-340
  • Peer Reviewed / Open Access