2012 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Analysis and synthesis of multi-dimensional immune organ network |
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| Project/Area Number |
24111002
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| Research Institution | National Institutes of Natural Sciences Okazaki Research Facilities |
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Principal Investigator |
高田 慎治 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(岡崎共通研究施設), 岡崎統合バイオサイエンスセンタ―, 教授 (60206753)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大久保 直 北里大学, 医学部, 講師 (10450719)
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| Project Period (FY) |
2012-06-28 – 2017-03-31
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| Keywords | 発生・分化 / 遺伝子 / 細胞・組織 / シグナル伝達 / 免疫学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
リンパ器官という「場」の作用を理解する上では、ストローマ細胞やその作用の分子的実体であるシグナル分子がはたす役割を解明することと同時に、ストローマ細胞の空間配置や分泌性のシグナル因子の空間分布がどのように制御されるのかを知ることが必要である。本研究では、胸腺内におけるストローマ細胞の空間配置と、分泌性シグナル因子の空間分布の制御に関して、Wntを分泌するストローマ細胞の空間配置の実態と「Wntシグナルの場」の規定に関わる分子基盤の解明と胸腺構造の構築とストローマ細胞の分化に関わるしくみの理解の２点から研究を進めている。平成２４年度においては以下のような成果が得られた。（１）生理的条件下でのWntタンパク質の空間分布を解析するためには組織免疫染色が１つの有効な手段であるが、これまでに作成された抗Wnt抗体のうち入手可能なものには組織免疫染色に適したものがない。それに対して、我々のグループで作成した抗Wnt3a抗体が組織免疫染色に適用可能なことから、これと同様な方法により複数のWntにおいて抗体作成に必要なタンパク質の調製を行った。（２）免疫組織染色に加え、EGFP-Wnt3aをWnt-3a遺伝子座に組み換えたノックインマウスを作製しWnt-3aのライブイメージングを行うことを計画している。平成２４年度は、無事にノックインマウス個体の作製に成功した。その結果、本マウスを用いて胸腺におけるWnt3aの挙動を解析することが可能になった。（３）我々は細胞外に分泌されたWntの高次構造や翻訳後修飾に多様性があることをすでに見いだしており、平成２４年度は翻訳後修飾や高次構造が異なるWnt3aタンパク質を調製するための予備的実験を行った。（４）咽頭弓においてripply3を発現した細胞の系譜解析を行うための予備的観察を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実績の概要にも述べた通り、本研究では、胸腺内におけるストローマ細胞の空間配置と、分泌性シグナル因子の空間分布の制御に関して、Wntを分泌するストローマ細胞の空間配置の実態と「Wntシグナルの場」の規定に関わる分子基盤の解明と胸腺構造の構築とストローマ細胞の分化に関わるしくみの理解の２点から研究を進めている。平成２４年度においては以下のような成果が得られた。（１）免疫組織染色が可能なWnt抗体の作成を目指し、複数のWntにおいて抗体作成に必要なタンパク質の調製を行った。（２）免疫組織染色に加え、EGFP-Wnt3aをWnt-3a遺伝子座に組み換えたノックインマウスを作製しWnt-3aのライブイメージングを行うことを計画している。平成２４年度は、無事にノックインマウス個体の作製に成功した。（３）我々は細胞外に分泌されたWntの高次構造や翻訳後修飾に多様性があることをすでに見いだしており、平成２４年度は翻訳後修飾や高次構造が異なるWnt3aタンパク質を調製するための予備的実験を行い、予定通りの成果を得た。（４）咽頭弓においてripply3を発現した細胞の系譜解析を行うための予備的観察を行い、系譜解析が可能であることを確認した。これらの結果は、平成２４年度に予定した研究がほぼ順調に進展していることを示している。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画に沿って以下のような研究を進めて行く。
１：ストローマ細胞の空間配置の実態と「シグナルの場」の規定に関わる分子基盤を明らかにするために下記の①から④の研究を、２：胸腺構造の構築とストローマ細胞の分化に関わるしくみを明らかにするために下記の⑤と⑥の研究を計画する。
① 胸腺内におけるWnt発現細胞とWntタンパク質の分布様式を明確にし、それが分化段階にある未成熟なT細胞とどのような位置関係にあるかを免疫組織染色等を駆使して検討する。特に、免疫組織染色により内在性Wnt-3aを高感度に検出できる希有な抗体の作成に成功していることから、本抗体と同様の方法により他のWntおよび関連因子に対する抗体の作成する。② EGFPを結合したWnt3aノックインマウスを作製し、胸腺におけるWnt3aの挙動をライブイメージングにより明らかにする。③ Wntの翻訳後修飾と高次構造の多様性を明らかにし、そのような多様性がWntの局在、挙動、活性にもたらす影響を培養細胞系、初期胚モデル系および胸腺（①と②で確立した胸腺におけるWntの空間分布の解析系）において検討する。④ Wntの局在、挙動、活性に影響をもたらす分子を培養細胞系や初期胚モデル系で同定するとともに、その変異体個体を作製して胸腺における役割を検討する。
⑤ Ripply3変異体胚における咽頭嚢から不分離の胸腺において、胸腺の構造、ストローマ細胞の構成、T細胞分化を解析するとともに、咽頭嚢における胸腺原基の形成や分離に関わる分子機構をtwo-hybridスクリーニング・マイクロアレイ・変異体作成等により明らかにする。⑥ Ripply3を発現する咽頭内胚葉から生み出される胸腺ストローマ細胞の系譜を解析する。
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Research Products
(5 results)
