2013 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Analysis and synthesis of multi-dimensional immune organ network |
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| Project/Area Number |
24111002
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| Research Institution | Okazaki Research Facilities, National Institutes of Natural Sciences |
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Principal Investigator |
高田 慎治 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(岡崎共通研究施設), 岡崎統合バイオサイエンスセンタ―, 教授 (60206753)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大久保 直 北里大学, 医学部, 准教授 (10450719)
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| Project Period (FY) |
2012-06-28 – 2017-03-31
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| Keywords | 発生・分化 / シグナル伝達 / 免疫 |
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| Research Abstract |
胸腺内におけるシグナル伝達の空間的制御に関して以下の研究を行った。
① 胸腺内におけるWnt産生細胞の空間配置を、胎生１５日および生後１日の胸腺において解析するとともに、胸腺での明瞭な発現が確認できたWnt4に対する抗体の作製に成功した。以上の結果により、Wntタンパク質とシグナル伝達の空間的解析を行う基盤の構築が進んだ。また、 胸腺におけるWntシグナル伝達を時空間的に解析することを目的に、ライブイメージング系の確立を試みた。Wntタンパクの可視化のために作成したEGFP-Wnt3aノックインマウスでは、EGFPの発現量が予想に反して低く、検出方法等の改良等が必要であることがわかった。一方、２光子顕微鏡による胸腺のイメージング系を目指し、胸腺ストローマ細胞でEGFPを発現するβ５t―EGFPマウス（徳島大学の高浜研究室より導入）を用いて、観察条件の検討を行った。さらに、Wntシグナルが活性化する細胞を可視化するために、高感度のWntレポーターマウスを用いて、胸腺組織において実際にWntの活性化を検出できることを確認した。
② 複数の培養細胞を用いて細胞外に分泌されたWntを解析し、Wntの種類ならびに細胞の種類等により、異なるフォームのWntタンパク質が分泌されているという結果を得た。
③ Wntの局在を制御することが予想されるヘパラン硫酸に着目し、その硫酸基転移酵素をアフリカツメガエルの上皮細胞系において過剰発現ならびに機能阻害することにより、細胞外におけるWntの局在はこの修飾によって大きく影響を受けることを明らかにした。
④ 咽頭弓形成に必須の因子であるRipply3と相互作用するタンパク質を酵母ツーハイブリッド法により探索した。その結果得られた２つの候補分子については咽頭弓での発現を確認するとともに、免疫沈降法によりRipply3と結合することを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
胸腺におけるWntの空間分布の解析とイメージング系の確立については概ね計画通りに進んでいる。ただし、EGFP-Wnt3aマウスは当初の予想ほど蛍光強度が高くない可能性があるため、代替手段についても検討する必要がある。Wntタンパク質の多様性については、新たなWntタンパク質の高次構造を発見できた可能性があり、この点では予想以上の成果をあげつつある。また、Ripply３に関しては、当初の計画には盛り込んでいなかった酵母ツーハイブリッド法が成功し、相互作用する因子として興味深いタンパク質が得られたことから、今後の展開が期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
胸腺におけるWntの空間分布とイメージングについては、２光子顕微鏡によるイメージング系が確立できつつあることから、この系においてストローマから免疫細胞へのWntの伝達とその際の両細胞とWntタンパク質のの時空間動態に焦点を当て、研究を展開して行く。Wntの多様性については、新しく同定したWnt高次構造の特徴と生理的意義に注目して研究を進める。また、Ripplyについては新たに発見した相互作用因子の機能に焦点を当てて研究を進める。
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