2014 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Analysis and synthesis of multi-dimensional immune organ network |
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24111002
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| Research Institution | Okazaki Research Facilities, National Institutes of Natural Sciences |
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Principal Investigator |
高田 慎治 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(岡崎共通研究施設), 岡崎統合バイオサイエンスセンタ―, 教授 (60206753)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大久保 直 北里大学, 医学部, 准教授 (10450719)
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| Project Period (FY) |
2012-06-28 – 2017-03-31
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| Keywords | 細胞・組織 / 発生・分化 / 免疫学 / シグナル伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１：胸腺皮質細胞におけるWntの機能と空間分布についての解析；胸腺におけるWnt発現細胞の同定のため、胸腺皮質上皮細胞(cTEC)においてWntの分泌を抑制するコンディショナルノックアウトマウスを樹立した。生後４週においてはT細胞と胸腺上皮細胞双方の数が減少し、胸腺上皮細胞におけるWntの活性化の低下が観察された。しかしながら、Wntシグナルの活性化は上皮細胞には認められたものの、T細胞には認められなかった。従ってcTECから分泌される Wntの主な作用点は、T細胞ではなく胸腺上皮細胞であることが示唆された。
２：Wntタンパク質の可視化とイメージング系の構築：すでに作製した抗Wnt抗体の多くが、これまで困難とされてきた内在性Wntタンパク質の検出もできることを確認した。また、Wntタンパク質の動態をイメージングするために、蛍光標識した２次抗体とともに抗Wnt抗体をアフリカツメガエル胚の胞胚腔に注入し、シグナルの検出に成功した。
３：Wntタンパク質の構造多様性の検討：昨年度までの研究により見いだされた新規フォームのWntの発現量や活性を複数種の培養細胞を用いて測定した。
４：Wntの局在、挙動、活性に影響をもたらす分子の解明：抗Wnt8抗体による免疫染色により、内在のWntが細胞膜の局所にクラスター状に局在化することが確認された。さらに、ヘパラン硫酸の糖鎖修飾が細胞外空間でのWntの局在制御とそれに伴うシグナル伝達の基盤となることが強く示唆された。
５：咽頭内胚葉の発生機構の解析：Ripply3と相互作用する因子について機能解析を進めた結果、Ripplyを介した転写制御には影響せず、むしろRipply3の細胞内局在を核から細胞膜近傍へと変化させることが明らかになり、咽頭弓の発生過程において、Ripply3および相互作用因子が転写制御以外に重要な働きをしていることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
以下に示す個別項目ごとの成果を総合的に判断した結果、本研究全体はおおむね順調に進展していると考えられる。
１：胸腺皮質細胞におけるWntの機能と空間分布についての解析においては、胸腺皮質上皮細胞(cTEC)においてWntの分泌を抑制するコンディショナルノックアウトマウスの樹立に成功し、予定通り解析をスタートさせることができた。また、このマウスとWntシグナルレポーターマウスを用いた解析からcTECから分泌される Wntの主な作用点は、T細胞ではなく胸腺上皮細胞であるという新たな可能性が示唆された。これらの成果から、本項目についての研究は当初の期待通りに進捗していると判断した。
２：Wntタンパク質の可視化についても、作成した多くの抗体が内在性Wntを検出できたことから、今後の研究に向けた十分な基盤ができたものと判断された。
３：Wntタンパク質の構造多様性については、複数の細胞種、複数のWntサブタイプを用いた系統的な解析が完了し、この課題に対する十分な解答が得られたものと判断された。
４：Wntの局在、挙動、活性に影響をもたらす分子の解明については、、Wntを細胞膜の局所にクラスター状に局在化させる分子の同定に成功し、Wntの空間分布の制御機構の理解に向けて大きな進展があった。
５：咽頭内胚葉の発生機構の解析については、Ripply3と相互作用する分子の解析から、Ripply3が咽頭嚢・胸腺原基の発生をこれまでの予想とは異なる新たな分子機構によって制御している可能性が示唆されることとなり、今後の展開に期待がもたれた。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの成果を基盤に今後は以下の点に焦点を当て研究を推進する。
１：胸腺皮質細胞におけるWntの機能と空間分布についての解析：Wntの分泌に必須であるWlsのコンディショナルノックアウトマウスを用いた解析が可能になったことから、このマウスを用いて、胸腺皮質上皮細胞から分泌されるWntの役割を詳細に解析する。特に、Wntシグナルの活性をモニターするレポーターマウスとの掛け合わせにより、Wntシグナルを受容する細胞を明確化し、それら細胞に対するWntの効果を解析するとともに、胸腺内での空間配置も解析する。
２：Wntタンパク質の可視化とイメージング系の構築：これまでに調製したWntに対する抗体によって、生体内における内在性Wntタンパク質の可視化が可能になったことから、Wntの局在化を時空間的に解析することを目的に、アフリカツメガエル胚をモデル系にWntタンパク質のライブイメージングを試みる。
３：Wntの局在、挙動、活性に影響をもたらす分子の解明：Wnt8がクラスター状の空間分布を呈し、その制御にヘパラン硫酸の糖鎖修飾が関わることが示されたことから、Wnt8以外のWntの空間分布についてもアフリカツメガエルの上皮細胞系を用いて解析を進める。
４：咽頭内胚葉の発生機構の解析：Ripply3と相互作用する因子が転写制御以外の作用を持つことが明らかになったことから、Ripply3変異体における細胞骨格系の異常を調べるとともに、相互作用因子のノックアウトマウスを作製し、表現型の解析を行う。また、魚類の咽頭弓の発生機構がマウスとは異なることに注目し、その発生に関わる分子の探索を行う。
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