2012 Fiscal Year Annual Research Report
シリア・中心体系のダイナミズムにおける基底小体・細胞骨格相互作用の役割
| Project Area | Cilium-centrosome system regulating biosignal flows |
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| Project/Area Number |
24113002
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
月田 早智子 大阪大学, 生命機能研究科, 教授 (00188517)
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| Project Period (FY) |
2012-06-28 – 2017-03-31
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| Keywords | Odf2 / 基底小体-中心体系 / アペンデージ |
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| Research Abstract |
本研究では、基底小体-中心体系と細胞膜・細胞骨格系との相互作用について、基底小体・中心体のアペンデージ構造体に特に注目した解析を行う。
１、新規Odf2 関連基底小体アペンデージ蛋白質の探索 : Odf2 関連アペンデージ蛋白質について、新規性のある蛋白質を、免疫沈降、及び、基底小体単離法の開発により検索を進めている。 (1) 免疫沈降による検索： Odf2 のN 末、C 末を認識する抗体作製を進めた。これらの抗体による免疫沈降により、Odf2結合タンパク質の検討を、気管や培養細胞などを用いて試みた。得られたバンドについて、質量分析を進めている。条件を修正しつつ、解析を続ける予定である。 (2) 機能ドメインの共沈降による検索： Odf2-KO-F9 細胞に種々の変異Odf2 分子を発現させることにより、基底小体のAf(Anchoring fiber) やBf(Basal foot) の各々の構築に重要なOdf2 の機能ドメインを特定してきた。機能ドメインの解析結果が得られ、論文として投稿中である。 (3) 気管からの基底小体の単離精製による検索：基底小体の丸ごとの単離精製法の確立を試みている。まだ十分ではないが、電顕を用いた精製度確認により、濃縮がかかる系にまで向上させることができた。本画分のOdf2を用いたウエスタンブロッティグでも、濃縮が確認されている。今後、さらに方法を改善し、精製度を高め、基底小体を構成する分子について、質量分析などと合わせることで、同定を試みて行きたい。
２、Afと細胞膜との結合の分子基盤の解析 : Odf2 やOdf2 関連アペンデージ蛋白質が、Af の構築にどのように関わり、基底小体の細胞膜への結合を制御するか、という課題について、基底小体側と細胞膜側から各々検討を行う。本年度は、電子顕微鏡学的な解析を中心に進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究では、基底小体-中心体系と細胞膜・細胞骨格系との相互作用について、基底小体・中心体のアペンデージ構造体に特に注目した解析を基盤に行うことを目指している。平成24年度では、まず、私たちが体細胞にも存在することを見出したOdf2(Outer dense fiber -2;電子顕微鏡で精子鞭毛の外側に電子密度の高い繊維として見出されていたが、体細胞での発現や機能については、知られていなかった。)蛋白質を足掛かりとして、新規Odf2 関連基底小体アペンデージ蛋白質の探索から進めた。Odf2は、私たちの研究から、中心体の母中心子のアオペンデージや繊毛基底小体のアペンデージに存在することが知られいている。本年度の研究では、蛍光染色や免沈用の良質な新規抗Odf2抗体も自家作製できた。いままでになく、蛍光抗体において有用なものであった。免疫沈降による検索では、結合タンパク質の得られたバンドについて、質量分析学的解析を進めている。機能ドメインの共沈降による検索では、私たちが以前作製したOdf2の遺伝子欠損細胞株であるOdf2-KO-F9 細胞に種々の変異Odf2 分子を発現させることにより、基底小体のAf やBf の各々の構築に重要なOdf2 の機能ドメインと２種アペンデージの分子構築の違いを特定してきた。機能ドメインの解析結果が得られ、論文投稿できるまでにまとまっている。さらに、気管からの基底小体の単離精製による検索では、基底小体の丸ごとの単離精製法の確立を試みており、素分画は得られている。２、Af と細胞膜との結合の分子基盤の解析では、本年度は、電子顕微鏡学的な解析を中心に進めた。以上のように、広く結果が得られつつあり、一部は、論文としてまとまりつつあるため順調に進展していると判断される。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成24年度の解析をさらに進める。Odf2の変異分子の解析による、そのアペンデージ構築の制御機構の解析は、微小管との相互作用の分析から、rab8,rab11の関与する膜輸送システムとのリンクを示唆するものであった。この役割について、イメージング等による解析を進める。また、新規Odf2関連基底小体アペンデージ蛋白質の探索として、Odf2 関連アペンデージ蛋白質について新規性のある蛋白質を、免疫沈降、及び、基底小体単離法の開発により検索する。具体的には、(1) 免疫沈降による検索：複数の抗体を用いる。Odf2 のN末、C末を認識する抗体を作製する。これらの抗体による免疫沈降を気管や培養細胞などを用いて試みる。Odf2 のノックアウト (KO) F9 細胞や、変異細胞、さらに、種々のOdf2 遺伝子を発現させた細胞について試みる。(2) 機能ドメインの共沈降による検索：Odf2-KO-F9 細胞に種々の変異Odf2 分子を発現させることにより、基底小体の2種類のアペンデージ構造であるAfやBf の各々の構築に重要なOdf2 の機能ドメインを特定したので、これらの機能ドメインの結合蛋白質の差異を検討し、AfやBfの特異的機能とその動態を検討する。 (1)と同様に気管や種々の培養細胞を用いる。(3)気管多繊毛上皮細胞における基底小体配向原理について、アペンデージ構造と細胞骨格の相互作用という視点からその原理の追求を行う。(4) 気管からの基底小体の単離精製による検索：基底小体の丸ごとの単離精製法の開発を試みる。野生型の気管やBf を欠失した気管から、基底小体の単離精製を行い、その構成成分についてプロテオミクスを試みる。両者の差をとって、Bf の構成蛋白質の同定を試みる。(5) 本解析に供するためにも、気管上皮などの初代培養系の立ち上げも進める。
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