2012 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of mechanisms of transcription cycle using multi-color, single-molecule, quantitative fluorescence imaging of living cell nuclei.
| Project Area | Integral understanding of the mechanism of transcription cycle through quantitative, high-resolution approaches |
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| Project/Area Number |
24118006
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
十川 久美子 東京工業大学, 生命理工学研究科, 准教授 (20291073)
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| Project Period (FY) |
2012-06-28 – 2017-03-31
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| Keywords | １分子イメージング / 転写調節 / 遺伝子 / 発現調節 / 生体分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、１分子イメージング観察と定量解析により、転写サイクルの動態観察と転写に関わるタンパク質群の個々の振る舞いや相互作用を、時空間の関数として高精細に定量することを目的としている。独自に開発した蛍光照明法である薄層斜光照明法による１分子イメージング観察と定量解析を、転写サイクルの動態観察により複雑な時空間制御の解明に向け、最適化を進めた。具体的には、以下のような成果を得た。
(1) 転写サイクル解析のための１分子イメージング顕微鏡システムの構築を進めた。1分子蛍光顕微鏡システム (3色同時観察可能) を発展させるため、4色同時観察系の構築に取り組んだ。さらに高速画像取得カメラを導入したことで、これまで以上にダイナミックな相互作用解析が可能になった。
(2) 複数種タンパク質同時発現細胞系の構築法最適化および蛍光抗体による標識を行い、多色１分子解析に向けて実験系を構築した。転写因子、RNAポリメラーゼ、リン酸化タンパク質などを同時に観察・計測することにより、個々のタンパク質動態だけでなく、相互作用の時空間動態が解析可能になる。1分子観察対象として、RNAポリメラーゼ、各種転写因子についてGFPまたはRFPとの融合タンパク質を同時に発現する細胞系の構築を進めた。発現量を低く生体内濃度以下に制御した上で１分子観察を行うために、発現プラスミド構築の要点として必要な、(i) 弱いプロモータの選択 (ii) 細胞に1コピーのみの遺伝子をFRTによる相同組換えにより導入した。この方法により、種々の転写因子とRNAポリメラーゼの１分子イメージングを進めた。さらに、生きた細胞内でのリン酸化セリンに対する抗体による蛍光標識法により、転写伸長型のRNAポリメラーゼを可視化することができた。これにより、転写サイクルのステージによる転写因子とRNAポリメラーゼの相互作用変化の解析が可能になった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究計画は、転写サイクル解析のために、１分子顕微鏡システム構築および観察対象サンプル調製方法を構築、最適化することであった。１分子顕微鏡システムは、4色同時観察系構築に加えて、画像取得高速化を計画に先行して進めた。これにより、従来のカメラでは解析できなかったミリ秒単位の短時間の相互作用を定量できるようになった。また発現細胞構築方法についても、１分子レベルで2色同時発現の細胞系構築はルーティンで行えるようになった。蛍光タンパク質を発現させるだけでなく、抗体による蛍光標識法を組み合わせることにより3色のリアルタイム１分子同時観察を進めることができた。4色同時観察用の細胞構築にも応用できる確証を得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
発現細胞構築方法が整ってきたので、RNAポリメラーゼと転写因子の相互作用を中心に、解析を進めていく。RNAポリメラーゼのC末端領域(CTD)のリン酸化レベルは、転写サイクルのステージにより変化する。リン酸化セリンに対する蛍光抗体での標識により、リン酸化レベルをモニターし、転写因子との相互作用との関係についても明らかにしていく。観察方法としては、１分子定量解析に加え、１分子FRETによる転写関連タンパク質とRNAポリメラーゼの相互作用解析をスタートさせる。
〔連携研究者〕
東京工業大学・大学院生命理工学研究科 徳永万喜洋 １分子顕微鏡システムおよび定量解析技術開発
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