2013 Fiscal Year Annual Research Report
生細胞核の複数種蛍光１分子イメージング定量解析による転写サイクルの機構解明
| Project Area | Integral understanding of the mechanism of transcription cycle through quantitative, high-resolution approaches |
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| Project/Area Number |
24118006
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
十川 久美子 東京工業大学, 生命理工学研究科, 准教授 (20291073)
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| Project Period (FY) |
2012-06-28 – 2017-03-31
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| Keywords | １分子イメージング / 転写調節 / 遺伝子 / 発現調節 / 蛍光観察 |
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| Research Abstract |
本研究は、生細胞１分子イメージング観察と定量解析により、転写サイクルの動態観察と転写に関わるタンパク質群の個々の振る舞いや相互作用を、時空間の関数として高精細に定量することを目的としている。独自に開発した蛍光照明法である薄層斜光照明法による１分子イメージング観察と定量解析を、転写サイクルの動態観察により複雑な時空間制御の解明に向け、最適化を進めた。具体的には、以下のような成果を得た。
(1)細胞の活性化に伴う転写因子の細胞質から核への移行を解析する目的で、核膜孔複合体の3色同時１分子イメージングの観察系を確立した。核膜孔複合体構成タンパク質を位置マーカーとして、核膜通過時のタンパク質の定量解析が可能になった。また、分裂酵母の核膜孔複合体構成タンパク質の蛍光１分子定量解析により、発芽酵母やヒトと異なる特徴的な組成を示すことが分かった（Nucleus 5, 1-14, 2004）。
(2)複数種タンパク質同時発現細胞系の構築法最適化において、１分子レベルでの発現細胞構築方法を改良した。ヒストンや転写伸長因子NELFなどのタンパク質では、(i)１コピーの遺伝子導入、(ii)弱いプロモータ支配下でも発現レベルが低下しない。SNAPタグ融合タンパク質に至適濃度の蛍光色素リガンドを添加することにより、NELFの１分子イメージング解析を可能にし、RNAポリメラーゼとの相互作用解析を進めることができるようになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究計画は、昨年度に引き続き、転写サイクル解析のために、１分子顕微鏡システム構築および観察対象サンプル調製方法を構築、最適化することであった。4色同時観察に必須である発現細胞構築方法について、改良を進め、昨年までの2色同時１分子レベル発現細胞に加えて、１分子レベルでのBFP/GFP/RFPの3色同時発現細胞構築もルーティンで行えるようになった。この方法により、細胞質－核間輸送の１分子定量解析を進めることができた。さらに抗体による蛍光標識法を加えて、4色同時観察用の細胞構築が可能になり、転写サイクル関連タンパク質のダイナミクス解析に応用できる確証を得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
3色同時発現を含めて発現細胞構築方法を確立できたので、RNAポリメラーゼと転写因子の相互作用を中心に、スプライシングやクロマチンリモデリング複合体など、転写調節に関与するタンパク質群を含めて解析を進めていく。領域内共同研究として、転写伸長調節因子NELF（山口）やアクチン関連タンパク質（原田）の解析を進めると同時に、領域外の核内タンパク質専門家を連携研究者に加えることにより、総合的に転写サイクルの時空間制御解明をめざす。
〔連携研究者〕
東京工業大学・大学院生命理工学研究科 徳永万喜洋 １分子顕微鏡システムおよび定量解析技術開発
大阪大学・大学院生命機能研究科 木村宏 リン酸化セリン蛍光抗体Fabによる転写サイクルモニター
熊本大学・発生医学研究所 斉藤典子 核スペックルタンパク質の動態解析
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