2014 Fiscal Year Annual Research Report
機能を生み出す単位生体分子集団（機能モジュール）の動的秩序の探査
| Project Area | Dynamical ordering of biomolecular systems for creation of integrated functions |
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| Project/Area Number |
25102003
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
上久保 裕生 奈良先端科学技術大学院大学, 物質創成科学研究科, 准教授 (20311128)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
片岡 幹雄 奈良先端科学技術大学院大学, 物質創成科学研究科, 教授 (30150254)
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| Project Period (FY) |
2013-06-28 – 2018-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / 動的秩序 / X線溶液散乱 / マルチドメイン蛋白質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生命システムにおいては、弱い相互作用で関連づけられた多種多様な蛋白質が、集合・離散を繰り返し様々な秩序状態をとること(動的秩序)によって機能を実現している。蛋白質分子集団が示す動的秩序を理解するためには、構成要素の存在比や外的要因に依存して、系の平衡状態がどのように応答するのかを定量的に分析することが必要となる。そこで、本研究では、系中に存在する複合体を含む全ての構成要素を区別し、その存在比率を定量的に評価することが可能な新たな測定/解析手法の開発研究を進めている。
量子ビーム溶液散乱測定からは、溶液中に存在する蛋白質の形に依存した散乱曲線が測定される。さらに、測定に用いる溶液の、種々の蛋白質の組成比率を任意に変化させ測定すれば、系中に含まれる全ての構造を同定できるだけでなく、その複合体種を規定する相互作用を定量的に評価することが可能となる。そこで本研究では、マイクロ流路技術を応用した「微量試料自動サンプリングシステム」を開発し、量子ビーム溶液散乱測定法と組み合わせることで当初の目的を達成しようとしている。当該年度は、3液混合タイプのマイクロ流路を新規に設計しサンプリングシステムの実証機を作製し、所属研究科に設置されたX線発生装置導入し、光応答性蛋白質分子複合系に対して実証実験を行った。その結果、光応答性蛋白質の活性種濃度の変調に伴う散乱曲線の変化を観測することに成功した。解析を進めたところ、活性種の存在比率に依存して、光応答性蛋白質と相互作用蛋白質の結合比が異なる複数の複合体種が形成されることが明らかとなった。この事実は、光応答性蛋白質自身は光に対してON/OFFの応答しか示さないにもかかわらず、相互作用蛋白質と共在する分子複合系では、光の強度に依存したアナログ出力を実現していることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（1）諸問題を解決した新規マイクロ流路を設計し、実証機作製とオフラインでの性能評価試験を行い、（2）放射光、X線発生装置に導入し標準試料等を用いた実証試験を行う予定であった。さらに、（3）「光応答性を示す蛋白質分子集団」と「神経軸索伸長に関わる蛋白質群」に適用し、これらの分子集団が示す動的秩序を解析することを計画していた。
（1）に関しては、マイクロ流路上の溶液の置換効率に問題があったため、観測部のサイズ・形状の変更、並びに、観測部から試料を廃液する流路を新たに設計し、実証機用のマイクロ流路を新たに作製した。着色液を用い、紫外可視吸収分光測定を行った結果、当初予定していた置換効率を達成できたことが確認できた。（2）については、放射光での実験は初期トラブルによって十分な実験を実施することができなかったが、X線発生装置への導入試験から、任意の蛋白質を任意の比率で混合した溶液を、条件を変えながら連続測定することが可能であることが実証された。この結果を受け、（3）の光センサー蛋白質と相互作用蛋白質が共存する溶液に対し、光センサーの活性種の濃度を線形的に変調させながらX線溶液散乱測定を行った。その結果、光応答性蛋白質の活性種濃度の変調に伴う散乱曲線の変化を観測することに成功し、光応答性蛋白質自身は光に対してON/OFFの応答しか示さないにもかかわらず、相互作用蛋白質と共在する分子複合系では、光の強度に依存したアナログ出力を実現していることが明らかとなった。これは、動的秩序がもたらす新しい生理機能の可能性を示唆するものである。「神経軸索伸長に関わる蛋白質群」の測定を予定していたが、蛋白質の発現、精製条件の検討に時間を要し、本実験は次年度に繰り越すこととした。
一部、計画していた実験を実施することができなかったものの、上述の通り、順調に計画を進めることができている。
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| Strategy for Future Research Activity |
「微量試料自動サンプリングシステム」の実用化には一定のめどが立ち、現在は多成分平衡状態から得られたデータの解析法の確立にフェーズがシフトしている。しかしながら、装置を放射光研究施設に持ち込み使用する際に、少なからずトラブルが発生し、ビームタイムを有効に利用できないことが問題となった。今後、測定効率を向上するために、放射光専用微量試料自動サンプリングシステムを新たに作製し導入する。本装置は、ビームライン担当者の協力のもと、一般ユーザーへの解放を進める。
システムの実用化にめどが立ったことを受け、今後は、生物学的意義、生物物理学的意義の高い蛋白質集団をターゲットとした応用研究を進める。すでに「光応答性を示す蛋白質分子集団」についてはデータ収集を始めており、動的秩序がもたらす新しい生理機能の可能性を示唆するに至っている。今後は、論文作成に向け、個々の複合体の溶液構造と安定性を定量的に評価する解析法の開発を進める。「神経軸索伸長に関わる蛋白質群」については、当該年度に発現、精製法を確立することができたので、トレッドミリングで実現される見かけの分子運動を駆動力に変換するメカニズムの解明を進める。さらに、本研究を実施するきっかけとなった「クラスリン被覆小胞輸送に関わる蛋白質群」として、マルチドメイン蛋白質（GGA）と多数の作用蛋白質群（Arf、積荷蛋白質受容体、ユビキチン）から構成される多成分平衡状態で生じる動的秩序の解析を進め、蛋白質分子が集団を形成して初めて実現される機能性の評価を進める。
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