2015 Fiscal Year Annual Research Report
機能を生み出す単位生体分子集団（機能モジュール）の動的秩序の探査
| Project Area | Dynamical ordering of biomolecular systems for creation of integrated functions |
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| Project/Area Number |
25102003
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
上久保 裕生 奈良先端科学技術大学院大学, 物質創成科学研究科, 准教授 (20311128)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
片岡 幹雄 奈良先端科学技術大学院大学, 物質創成科学研究科, 理事・副学長 (30150254)
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| Project Period (FY) |
2013-06-28 – 2018-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / 動的秩序 / X線溶液散乱 / マルチドメイン蛋白質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生命システムにおいては、弱い相互作用で関連づけられた多種多様な蛋白質が、集合・離散を繰り返し様々な秩序状態をとること(動的秩序)によって機能を実現している。蛋白質分子集団が示す動的秩序を理解するためには、構成要素の存在比や外的要因に依存して、系の平衡状態がどのように応答するのかを定量的に分析することが必要となる。そこで、本研究では、系中に存在する複合体を含む全ての構成要素を区別し、その存在比率を定量的に評価することが可能な新たな測定/解析手法の開発研究を進めている。
量子ビーム溶液散乱測定からは、溶液中に存在する蛋白質の形に依存した散乱曲線が測定される。さらに、測定に用いる溶液の、種々の蛋白質の組成比率を任意に変化させ測定すれば、系中に含まれる全ての構造を同定できるだけでなく、その複合体種を規定する相互作用を定量的に評価することが可能となる。そこで本研究では、マイクロ流路技術を応用した「微量試料自動サンプリングシステム」を開発し、量子ビーム溶液散乱測定法と組み合わせることで当初の目的を達成しようとしている。
当該年度は、放射光利用専用の微量試料自動サンプリングシステムを新たに作製し、放射光実験施設への導入、及び、実在系への応用を行った。実在系の機能性を生み出す分子集団として、「クラスリン被覆小胞輸送に関わる蛋白質分子集団」、及び、「神経軸索伸長に関わる蛋白質分子集団」を対象として解析を行った。以上の実験を通じ、微量試料自動サンプリングシステムを用いた滴定X線溶液散乱測定が多成分平衡状態中の構造・相互作用評価において有力な測定手法であることが検証できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度は（1）放射光利用専用の微量試料自動サンプリングシステムを新たに作製し、放射光実験施設への導入し、実在系への応用として（2）クラスリン被覆小胞輸送に関わる蛋白質分子集団と（3）光応答性蛋白質分子集団への応用を予定していた。
（1）に関しては、放射光利用に適した流速を実現するために再設計したマイクロ流路を作製し、順調に導入試験を行うことができた。導入試験に引き続き、（2）についてGGA(VHS-GAT) /M6PR /Ub 、4成分存在下での構造相互作用解析を試み、複数あると考えられてきたGGAに対するUb結合部位は、マルチドメイン状態では1カ所しか存在せず、この結合はGGAに対してM6PRが作用することに影響を受けないことが明らかとなった。(3)については、当初、光応答性蛋白質分子集団への応用を優先する計画であったが、領域内共同研究で進めている神経軸索伸長に関わる蛋白質分子集団の解析を優先して実施することとした。本研究においても、Shootin1の溶液構造解析を進めると同時に、アクチン繊維とShootin1の結合を仲介すると考えられているCortactinとの相互作用解析を行った。Shootin1とCortactinの結合はShootin1のリン酸化によって制御を受けていると考えられているが、非リン酸化状態でもμM程度の解離定数を示す結合が生じることが明らかとなった。
（2）（3）について、まだ論文投稿にまで至っていないが、上述の通り、実在系への応用も順調に進み、微量試料自動サンプリングシステムを用いた滴定X線溶液散乱測定が多成分平衡状態中の構造・相互作用評価において有力な測定手法であることが検証でき順調に計画を進めることができている。
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| Strategy for Future Research Activity |
「微量試料自動サンプリングシステム」の実用化には一定のめどが立ち、現在は多成分平衡状態から得られたデータの解析法の確立にフェーズがシフトしている。当該年度は、放射光専用の微量試料自動サンプリングシステムを作製し、導入を進めている。これまでの発表を通じ、放射光利用ユーザーからの反響も大きく、現在、ビームライン担当者と協議を重ね、X線溶液散乱測定の標準測定法として利用を推進していくことを計画している。
実在系への応用についても、神経軸索伸長に関わる蛋白質分子集団を構成する蛋白質の大量発現系の構築も進み、次年度以降、Shootin1を中心とした集合離散現象の解析をさらに進める。ここでは特に、Shootin1のリン酸化に伴う構造変化を同定し、その上で、相互作用蛋白質群との構造・相互作用解析を行い、生化学的に予測されているリン酸化による相互作用の変調と最終的な複合体構造の同定を進める。クラスリン被覆小胞輸送に関わる蛋白質分子集団については、すでに多成分系での実験を実施しており、論文発表を念頭に再現性の確認とデータ精度の向上を進めていく。
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