2013 Fiscal Year Annual Research Report
生命分子システムの有機化学的拡張による動的秩序の創出
| Project Area | Dynamical ordering of biomolecular systems for creation of integrated functions |
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| Project/Area Number |
25102006
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Research Institution | Japan Advanced Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
芳坂 貴弘 北陸先端科学技術大学院大学, マテリアルサイエンス研究科, 教授 (30263619)
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| Project Period (FY) |
2013-06-28 – 2018-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / 生体分子 / バイオテクノロジー / 非天然アミノ酸 |
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| Research Abstract |
本研究では、非天然アミノ酸導入技術を用いて、タンパク質の本来の機能と人工的な動的秩序形成能を併せ持つ人工タンパク質の創出を目指している。まず、蛍光標識非天然アミノ酸を用いて、タンパク質の機能を蛍光変化として検出することも試みた。既に一本鎖抗体のN末端部位に蛍光標識アミノ酸を導入することで、抗原の結合を蛍光変化として検出できることを見出しているが、さらにC末端側に蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)のドナーとなる蛍光標識アミノ酸を導入する、あるいは緑色蛍光タンパク質を融合する、ことにより抗原の結合を蛍光強度比の変化として検出できる手法を開発した。この手法は、細胞内などでの抗原のレシオイメージングに応用できる。また、糖結合タンパク質（レクチン）に対しても糖基質の結合を蛍光変化として検出できることを実証した。
一方、非天然アミノ酸導入タンパク質の新規合成法の開発も行なった。非天然アミノ酸導入タンパク質の合成に使用する無細胞翻訳系は収量が低く、種々の機能評価を行なうために十分な量のタンパク質を得ることが困難であった。そこで、非天然アミノ酸を基質とするアミノアシルtRNA合成酵素変異体とアンバーサプレッサーtRNAを大腸菌中で共発現させることで、非天然アミノ酸導入タンパク質を大量発現させることを可能にした。さらに、芳香族アミンを有する非天然アミノ酸をタンパク質に導入しておき、アルデヒド誘導体を弱酸性下で還元的アルキル化反応を行なうことで、部位特異的かつ高効率にタンパク質を蛍光分子などによって修飾できることを明らかにした。また、光異性化分子や光架橋分子など有する非天然アミノ酸を導入したタンパク質の発現系の構築も進めた。
その他、光応答性非天然アミノ酸の導入によるタンパク質の複合体形成の光による制御や、糖修飾タンパク質の合成に向けた糖アミノ酸のタンパク質への導入などを行なった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
非天然アミノ酸導入タンパク質の新規合成法の開発に関しては、大腸菌を用いた大量発現系が構築でき、順調に進んでいる。また、蛍光標識アミノ酸や光応答性アミノ酸の導入によるタンパク質の動的秩序形成の制御・計測は、一部のタンパク質について達成されており、今後さらに対象タンパク質を広げて検討を進める。一方、種々の非生体分子系をタンパク質へ導入する手法に関して、芳香族アミン含有アミノ酸とアルデヒドを用いた修飾方法が開発できており、今後、非天然分子系の種類を拡張していく。
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| Strategy for Future Research Activity |
非天然アミノ酸導入タンパク質の大量発現系において、タンパク質の収量がまだ低く、改善を要する。そのために、非天然アミノ酸を認識するアミノアシルtRNA合成酵素変異体を分子進化工学により取得することを試みる。また、非天然アミノ酸導入タンパク質の修飾方法について、修飾に適した合成経路を確立し、タンパク質の動的秩序形成能の評価へ応用する。
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