2015 Fiscal Year Annual Research Report
生命分子システムの有機化学的拡張による動的秩序の創出
| Project Area | Dynamical ordering of biomolecular systems for creation of integrated functions |
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| Project/Area Number |
25102006
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| Research Institution | Japan Advanced Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
芳坂 貴弘 北陸先端科学技術大学院大学, マテリアルサイエンス研究科, 教授 (30263619)
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| Project Period (FY) |
2013-06-28 – 2018-03-31
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| Keywords | タンパク質 / 非天然アミノ酸 / 蛍光 / 光機能 / タグタンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
非天然アミノ酸のタンパク質への導入技術は、光機能性分子や蛍光標識分子などの人工機能分子をタンパク質に組み込むことで、タンパク質複合体形成などの生体分子の動的秩序の制御や検出に有用である。しかし従来の手法では無細胞翻訳系を用いる必要があり、タンパク質の発現効率の低く各種分析手法に適用する上で障害となっていた。そこで本研究では、非天然アミノ酸導入タンパク質の大腸菌内での大量発現系の確立を進めており、27年度は実際に光機能を付与したタンパク質の大量発現を行った。光異性化分子（アゾベンゼン）および光架橋分子（ベンゾフェノン）を有する非天然アミノ酸を認識するアミノアシルtRNA合成酵素変異体と、アンバーサプレッサーtRNAを用いて、一本鎖抗体へ非天然アミノ酸の導入を行った。その結果、良好な収率で非天然アミノ酸導入タンパク質が取得でき、光照射による抗原タンパク質との結合活性制御、およびタンパク質複合体の光架橋を確認できた。また、光架橋と蛍光標識を同時に行うことのできる非天然アミノ酸導入タンパク質の合成方法を新たに開発した。加えて、新たな非天然アミノ酸認識アミノアシルtRNA合成酵素変異体の分子進化を、無細胞翻訳系を内包したリポソームを用いたin vitro selection法により試みた（A02班松浦班員との共同研究）。
一方、非天然分子をタンパク質へ導入するための新規手法の開発も行った。まず、弱酸性溶液中でアルデヒド誘導体を用いてアミノ基の還元的アルキル化を行うことで、N末端アミノ基を選択的に修飾できることを見いだした。また、SNAPタグタンパク質融合と蛍光標識SNAPリガンド添加により、一本鎖抗体の近傍に蛍光分子を局在させ、抗原の結合を蛍光変化により検出できることを示した。この場合、非天然アミノ酸の導入を必要とせず、非天然分子導入タンパク質を細胞に直接発現させることも可能であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまで進めてきた非天然アミノ酸導入タンパク質の大腸菌内での合成法に関して、実際に良好な収率で光異性化および光架橋性の非天然アミノ酸を導入したタンパク質を得ることができた。また、非天然分子をタンパク質へ導入する手法に関して、N末端アミノ基をアルデヒドを用いて修飾する手法、および、SNAPタグタンパク質を介して非天然分子をタンパク質に付加する手法を検討し、抗体－抗原結合の蛍光検出に応用できることを示した。以上の点から、概ね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
非天然アミノ酸導入タンパク質の大量発現系を構築することができたことから、今後は領域内での共同研究により時間分解測定等によるタンパク質の動的秩序形成過程の計測や機能制御を試みる。また、非天然分子の新たな導入法を用いて、蛍光分子以外の非天然分子をタンパク質に付加して、その人工機能を発現することを試みる。光応答性分子や超分子構造を形成する高分子をSNAPタグタンパク質を介して目的タンパク質に付加して、タンパク質の制御・検出や動的秩序形成を試みる。この手法では、非天然分子とタンパク質と複合化を細胞内で行うことも可能になるため、今後、細胞内でのタンパク質の制御や動的秩序形成も可能になると期待される。
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[Presentation] N末端特異的に蛍光標識したIgGによる抗原の蛍光検出2015
Author(s)
渡邉 貴嘉, 福永 圭佑, Dian Novitasari , 芳坂 貴弘, 阿部 亮二, 大橋 広行
Organizer
BMB2015（第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会）
Place of Presentation
神戸国際会議場他（兵庫県神戸市）
Year and Date
2015-12-01 – 2015-12-04
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