2016 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of novel in vitro systems to produce mammalian oocytes
| Project Area | Mechanisms regulating gamete formation in animals |
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| Project/Area Number |
25114008
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
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Principal Investigator |
尾畑 やよい 東京農業大学, 応用生物科学部, 教授 (70312907)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平尾 雄二 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 畜産研究部門, ユニット長 (10355349)
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| Project Period (FY) |
2013-06-28 – 2018-03-31
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| Keywords | 卵胞形成 / エストロジェン / 卵胞培養 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成27年度までに開発した「卵子形成を再現する体外培養系」を軸に、卵形成機構を解明するため、本年度は以下の研究を行った。
1）成体マウス卵巣内の原始／一次卵胞から卵を産生する新規in vitro系の構築
ピンセットとタングステン針で成体マウス卵巣から原始／一次卵胞を単離した。1卵巣当たりおよそ10卵胞が単離できた。得られた卵胞は、5% 代替血清物（SPS）、100 ng/ml SCF、100 ng/ml GDF9、および0.1IU/ml FSH添加alphaMEM培地内で培養した。培養には96ウェルディッシュを用い、1卵胞を1ウェルで培養し培養後の発育を個々に追跡した。原始卵胞の培養7日後の生存率は57%、このうち成長した卵胞は25%存在したが、ほぼ多くの原始卵胞が体内と同様、体外でも成長せずに静止状態にあることが示された。一方、一次卵胞は、培養7日後の生存率が42%、このうち成長が認められたものは85%だった。これらの卵胞をさらに培養すると胞状卵胞に発育し、第二減数分裂中期卵を得ることができた。
2）卵形成および卵胞形成を制御する因子の探索
これまでの研究で、in vitroで卵胞形成を遂行するためにはエストロジェン受容体の阻害剤（ICI）を添加し、体内と比較して過度に活性化されているエストロジェンシグナルを抑制する必要があることが示された。本年度は、既知の3種のエストロジェン受容体（ESR1、ESR2、Gper1）のうちどの受容体をを介して、卵胞形成異常が生じているのか、RNA-seq解析と培地への特異的阻害剤添加実験で検証した。その結果、ESR1特異的阻害剤を添加すると有意に卵胞形成が改善されることが明らかとなり、またこれを介してin vitroの卵巣で異所的に発現する遺伝子群が存在し、これらが卵胞形成を阻害していることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1）成体マウス卵巣内の原始／一次卵胞から卵を産生する新規in vitro系の構築
一次卵胞の体外培養については、成熟卵が得られる状態まで培養系が検討されており、体外受精後の発生能を証明することができれば、in vitro系を構築したことになる。現在、発生能試験を行っており、概ね順調に進んでいると判断した。また、一次卵胞であるか原始卵胞であるかの判断は、卵胞の形状の目視で行っているが、原始卵胞を7日間培養しても成長しないものを真の原始卵胞と判定することができる。今後、原始卵胞の活性化機構を解明するためのin vitro系は構築できたものと判断している。
2）卵形成および卵胞形成を制御する因子の探索
平成28年度は、in vitroにおける卵胞形成異常の一因について明らかにしていることから、概ね順調に進んでいると判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
1）成体マウス卵巣内の原始／一次卵胞から卵を産生する新規in vitro系の構築
一次卵胞の体外培養については、成熟卵が得られる状態まで培養系が検討されており、平成29年度は受精能および発生能試験を行っていく。また、原始卵胞の活性化機構を解明するためのin vitro系が構築できたため、今後は、既報で卵胞を活性化することが知られるbpV（PTEN阻害剤）などにより活性化が誘起できるか否かを解析する。一方、成体マウス卵巣内の原始／一次卵胞の回収効率は依然として低く、培養後の生存率も低い。これは、幼齢マウスの卵巣を用いた場合も同様である。これらについては、少しでも効率が良くなるよう、さらに種々の方法を検討する。
2）卵形成および卵胞形成を制御する因子の探索
これまでの研究で、in vitroではエストロジェンシグナルの活性化により卵胞形成が阻害されており、エストロジェン受容体の阻害剤を培地に添加することで卵胞形成が改善されることが明らかになった。しかし、体内では母体からもエストロジェンが合成・供給されており、胎仔卵巣がエストロジェンに暴露される可能性がある。そのため、我々は、胎仔体内ではエストロジェンがエストロジェン受容体に結合するのを阻害する機構があるのではないかと考えている。今後は、in vitroで得られた知見をin vivoにフィードバックすることを目指す。
具体的には、in vitro由来卵巣で有意に5倍以上発現低下が認められた、ステロイド合成酵素の機能等に着目する。エストロジェン受容体に結合するものはステロイド骨格を保持している可能性が高く、我々が用いたエストロジェン受容体の阻害剤（ICI）もステロイド骨格を有する。そこで、発現低下が認められたステロイド合成酵素のうち卵巣での機能が明らかでない遺伝子に着目し、ゲノム編集でその機能解析を実施する。
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| Remarks |
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[Journal Article] Reconstitution in vitro of the entire cycle of the mouse female germ line2016
Author(s)
Hikabe O, Hamazaki N, Nagamatsu G, Obata Y, Hirao Y, Hamada N, Shimamoto S, Imamura T, Nakashima K, Saitou M, Hayashi K.
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Journal Title
Nature
Volume: 539
Pages: 299-303
DOI
Peer Reviewed
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