2013 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Dynamic chromatin structure and function |
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| Project/Area Number |
25116006
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Research Institution | National Institute of Information and Communications Technology |
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Principal Investigator |
原口 徳子 独立行政法人情報通信研究機構, 未来ICT研究所, 上席研究員 (20359079)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
淺川 東彦 大阪大学, 生命機能研究科, 助教 (70399533)
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| Project Period (FY) |
2013-06-28 – 2018-03-31
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| Keywords | 細胞・組織 / 細胞核 / クロマチン / 細胞構造 / タンパク質 |
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| Research Abstract |
細胞増殖や発生過程におけるクロマチン機能を保証する核膜の構造とその分子基盤を明らかにすることを目的とする。本年度は３項目に関して研究を行い、以下の成果を得た。
１）人工ビーズを用いたクロマチン機能に必要な核膜因子の同定： DNAを結合した人工ビーズを生きたHeLa細胞に導入し、ビーズ周辺で誘導される核膜構造を、蛍光イメージング法を用いて解析した。その結果、細胞内に入ったビーズのDNAに、クロマチンタンパク質barrier-to-autointegration factor (BAF)が結合することによって、ビーズ周辺に核膜様の膜構造が形成されることが分かった。RNAi干渉法を使った各種タンパク質のノックダウンから、この核膜様膜構造形成は、オートファジー膜形成と拮抗することが分かった。この結果は、細胞内に侵入した外来DNAがオートファジーの自食作用により消失するのを、核膜が防ぐ働きをすることを示している。
２）天然微小核を用いたクロマチン機能を保証する核膜因子の解明： U2OS細胞で高頻度に見られる微小核の核膜を、間接蛍光抗体法を用いて解析した。その結果、通常の核と比較して、量が少ない核膜タンパク質が存在すること、核膜裏打ちタンパク質のラミンが少ない場所があることが分かった。
３）進化的に保存された核膜タンパク質のクロマチン機能に果たす役割の解明：核膜孔複合体に着目して研究を行った。分裂酵母の核膜孔複合体を構築するタンパク質（ヌクレオポリン）を31種類同定した。各ヌクレオポリンについて、欠失変異体を作成し、増殖に必須かどうか検討した。増殖に必須なヌクレオポリンは15種類、必須でないものが16種類であった。増殖に必須でないヌクレオポリンであっても、欠質させると、減数分裂過程に異常がでるものが11種類あった。この結果は、ヌクレオポリンが生殖細胞形成に重要な役割を果たすことを示している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
初年度となる本年度、細胞内に導入したDNAビーズを用いた解析では、RNAiによるノックダウンを行うことによってBAFが核膜様の膜形成に重要であることを明らかにすることができた。この成果は、当初では次年度に想定していたものである。また、微小核では、ラミンなどの核膜タンパク質に異常があることが分かった。分裂酵母の核膜孔複合体を構成する全ヌクレオポリンを同定し、それらの多くが増殖や生殖細胞の形成に必要であることを証明した。この結果は、論文(Asakawa et al, Nucleus, 2014)として発表した。これらの成果から、当初の計画以上に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
DNAビーズだけでなく、今後は、目的タンパク質をビーズ上に結合させる方法を開発する。可能ならば、結合量や結合方向（N末端かC末端か）を任意に選ぶことができる方法を開発したい。それによって、目的タンパク質を思い通りに選び、量・質というさまざまな条件で、目的タンパク質の機能を調べることができるようになる。天然微小核を用いた研究では、蛍光生細胞イメージング法とRNAiによるノックダウンを使って、微小核の維持に働く核膜因子を同定する。進化的に保存された核膜タンパク質としてLEM2とヌクレオポリンに着目し、これまで不明だった核膜タンパク質とクロマチン機能・構造との関連を、遺伝学やイメージング法を用いて明らかにする。特に、目的タンパク質の変異体と野生株のミニ染色体の脱落頻度を比較することによって、核膜タンパク質のセントロメア機能について明らかにしたい。
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[Journal Article] Recruitment of the autophagic machinery upstream of LC3 is mediated by ubiquitin on host endosomal membranes during infection-induced autophagy2013
Author(s)
Fujita, N, Morita, E., Itoh, T, Tanaka, A, Nakaoka, M, Osada, Y, Umemoto, T, Saitoh, T, Nakatogawa, H, Kobayashi, S, Haraguchi, T, Guan, J-L, Saito, K, Ishibashi, K, Akira, S, Fukuda, M, Noda, T, Yoshimori T.
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Journal Title
J. Cell Biol.
Volume: 203
Pages: 115-128
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Non-invasive handling of chromatin fibers isolated from individual cells in a microchannel utilizing an optically driven microtool- Toward direct epigenetic analysis under microscope-2013
Author(s)
Oana, H, Nishikawa, K, Matsuhara, H, Yamamoto, A., Yamamoto, T.G, Haraguchi, T, Hiraoka, Y, Washizu, M.
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Journal Title
Proc. 17th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences (MicroTAS 2013)
Volume: -
Pages: 1995-1997
Peer Reviewed
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[Presentation] Non-invasive handling of chromatin fibers isolated from individual cells in a microchannel utilizing an optically driven microtool –Toward direct epigenetic analysis under microscope-2013
Author(s)
Oana, H. Nishikawa, K, Matsuhara, H, Yamamoto, A, Yamamoto, TG, Haraguchi, T, Hiraoka, Y, Washizu M.
Organizer
The 17th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences
Place of Presentation
Messe Freiburg (Freiburg, GERMANY)
Year and Date
20131027-20131031
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[Presentation] Comprehensive characterization of nucleoporins reveals structural difference between MAC and MIC nuclear pore complexes of Tetrahymena thermophila
Author(s)
Iwamoto, M, Osakada, H, Mori, C, Nagao, K, Obuse, C, Hiraoka, Y, Haraguchi, T.
Organizer
FASEB meeting “CILIATE MOLECULAR BIOLOGY”
Place of Presentation
Steamboat Springs(Bethesda, USA)
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[Presentation] Fission yeast nuclear membrane proteins that affect chromosome movements
Author(s)
Tange, Y, Asakawa, H, Yang, H-J, Chikashige Y, Haraguchi, T, Hiraoka Y.
Organizer
EMBO Conference on Fission Yeast: pombe 2013
Place of Presentation
Senate House(London, UK)
Invited
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