2015 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Dynamic chromatin structure and function |
|---|
| Project/Area Number |
25116006
|
|---|
| Research Institution | National Institute of Information and Communications Technology |
|---|
Principal Investigator |
原口 徳子 国立研究開発法人情報通信研究機構, 未来ICT研究所バイオICT研究室, 主任研究員 (20359079)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
淺川 東彦 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (70399533)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2013-06-28 – 2018-03-31
|
| Keywords | 細胞・組織 / 細胞核 / クロマチン / 細胞構造 / タンパク質 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
細胞増殖や発生過程におけるクロマチン機能を保証する核膜の構造とその分子基盤を明らかにすることを目的とする。本年度は、次の３項目に関して研究を行い、以下の成果を得た。
１）人工ビーズを用いたクロマチン機能に必要な核膜因子の同定： 細胞質内に取り込ませた人工ビーズの表面にエフェクター分子を結合させ、その表面で起こる現象を観察する実験系を確立した。エフェクターとしてDNAを結合したビーズの表面で起こる現象を解析したところ、核膜に類似した膜構造が集合した。その核膜集合の責任因子を解析し、BAF結合ビーズでも同様の核膜形成が起こること、BAFノックダウンで核膜形成が減弱することから、BAFであることを明らかにした。また、この核膜形成は、オートファジー膜形成と競合的であり、DNAがオートファジーによって分解されるのを防ぐ働きをすることを明らかにした。同様の方法で、BAF以外の核膜形成因子について解析を進め、複数の候補因子を発見した。
２）天然微小核を用いたクロマチン機能を保証する核膜因子の解明：ヒト骨肉腫細胞のU2OS細胞で高頻度に見られる微小核構造を、生細胞蛍光イメージング法を用いて可視化した。微小核の核膜の一部が破裂して核タンパク質が細胞質に流出する核では、核膜の裏打ち成分であるラミンが不均一であり、核膜が脆弱化していることが分かった。
３）進化的に保存された核膜タンパク質のクロマチン機能に果たす役割の解明：ヌクレオポリンNup132タンパク質のクロマチン機能に対する役割を解析した。蛍光イメージング法と遺伝学的手法を用いて解析し、Nup132が減数第一分裂でのセントロメア構造の構築に重要な働きをすることを明らかにした。またミニ染色体の脱落頻度の解析から、LEMドメインタンパク質が、セントロメア機能に役割があることが分かった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
１）人工ビーズを用いたクロマチン機能に必要な核膜因子の同定： DNAビーズの周辺に形成される核膜形成に関与する責任因子がBAFであることを、Live CLEM法などの蛍光イメージング法やRNAiによる特定因子のノックダウンを組み合わすことによって、明確に示した。また、このBAF依存的に形成される核膜には、オートファジーを排除する能力が備わっていることを論文で報告した。この成果は、トランスフェクションやウイルス感染時の外来DNAが、オートファジーを免れる分子基盤を明らかにしたものである。
２）天然微小核を用いたクロマチン機能を保証する核膜因子の解明：微小核構造と機能の関係を知るためには、生きた細胞で微小核の機能を知る方法が必要である。今年度は、生細胞蛍光イメージング法と光顕電顕相関イメージング法（CLEM 法）を組み合わせたlive CLEM法を用いて、微小核が破綻したときの核構造を詳細に検討し、核膜構造に異常があることが分かった。
３）進化的に保存された核膜タンパク質のクロマチン機能に果たす役割の解明：ヌクレオポリンが生殖細胞形成に果たす役割を解析し、Nup132が、第一減数分裂期の正常なセントロメア構造の形成に重要であることを発見した。さらに、核膜タンパク質LEM2の機能についても解析を進め、増殖期のセントロメア機能に重要であることを発見した。論文発表準備を進めている。
すべての項目で、目標を達成しており、関連の論文を発表することができたことから順調に進展しているとした。
|
| Strategy for Future Research Activity |
昨年同様、以下のことを検討しながら、研究開発を進めていく。
まず、人工ビーズを用いたクロマチン機能に必要な核膜因子の同定では、 目的タンパク質をビーズ上に結合させる方法の開発を行う。可能ならば、結合量や結合方向（N末端かC末端か）を任意に選ぶことができる方法を開発したい。それによって、目的タンパク質を思い通りに選び、量・質というさまざまな条件で、目的タンパク質の機能を調べることができるようになる。また、クロマチン（あるいはヌクレオソーム）を結合したクロマチンビーズを作製し、細胞内に導入し、クロマチンと DNAとの違いを解析する。細胞質内に目的ビーズを効率よく入れるために、エンドソーム膜を効率よく破る方法を開発したい。
天然微小核を用いた解析では、蛍光生細胞イメージング法とRNAiによるノックダウンを使って、微小核の維持に働く核膜因子を同定する。そのターゲットとなるタンパク質を選定するために、微小核で有意に減少している因子に着目して研究を進める予定である。
進化的に保存された核膜タンパク質としてLEM2、bqt4、Nup98、Nup132などに着目し、核膜タンパク質とクロマチン機能・構造との関連を、遺伝学と蛍光イメージング法あるいは電子顕微鏡法を用いて明らかにする。特に、目的タンパク質の変異体と野生株のミニ染色体の脱落頻度を比較することによって、核膜タンパク質のセントロメア機能について明らかにしたい。
|
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
[Presentation] 生細胞イメージング2015
Author(s)
原口徳子
Organizer
第25回細胞生物学ワークショップ
Place of Presentation
情報通信研究機構（兵庫県・神戸市）
Year and Date
2015-07-29 – 2015-07-29
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
