2014 Fiscal Year Annual Research Report
１分子in vivoイメージング超解像ナノ解析によるクロマチン動作原理解明
| Project Area | Dynamic chromatin structure and function |
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| Project/Area Number |
25116007
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
徳永 万喜洋 東京工業大学, 生命理工学研究科, 教授 (00192659)
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| Project Period (FY) |
2013-06-28 – 2018-03-31
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| Keywords | 生物物理 / 超解像イメージング / 細胞情報・動態 / クロマチン動構造 / ナノ定量解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
光学顕微鏡超解像イメージングの大きな国際的潮流が起こっているが、現在用いられている方法ではリアルタイム性・生細胞観察との両立に難があった。これを克服すべく顕微鏡技術・解析技術開拓を行い、新学術研究領域「動的クロマチン構造の解明」内の共同研究を展開して、クロマチン動態解明を行った。
１．生細胞多色１分子イメージング超解像顕微鏡と、多色超解像ナノ解析・定量化法の開発。１分子イメージング技術を用い、リアルタイム多色同期イメージングの超解像解析技術を構築した。10nmオーダーの解像度達成に向けて、時間変動・多色間位置ずれの高難度問題を克服する方法を開拓した。
２．ヌクレオソーム生細胞動態。１分子超解像軌跡追跡と、FRAP法（木村班と共同研究）と融合解析し、ヌクレオソーム動態に関する新しい描像を得た。
３．ヒストンバリアント生細胞動態。ヒストンH2・H3バリアントをGFP標識した生細胞の１分子観察とFRAP法により、動態研究を推進した（胡桃坂班・木村班・大川班と共同研究）。
４．クロマチンリモデリング複合体生細胞動態。同手法により、アクチン関連分子ArpやIno80のクロマチンリモデリングタンパク質とヌクレオソーム相互作用動態に関する新しい描像を得た（原田班・木村班と共同研究）。
５．高精度超解像解析のための脂質二重膜構築法。流動性を確保して基板上に分子・細胞を保持する簡便な方法を開発した。従来法では、煩雑なガラス表面洗浄処理や専用装置が必要であるため、試料調整に困難が伴い利用が限られていた。本研究で開発した方法は、脂質二重膜をガラス基板上に、均一な膜を再現性高く、簡便に作製できる。生細胞イメージング・１分子解析・in vitro表面分子分析など、広汎な利用を可能にするもので、クロマチン構造変化の超解像解析においても高精度計測を可能にした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
超解像ナノ解析法の新規開拓と細胞核動態観察最適化による、クロマチン構造の細胞レベルin vivo分子動態・要素間相互作用・核内配置の動態解明という目的を達成すべく、本年度の研究計画は、「１．超解像顕微鏡の開発構築」、「２．解析法と定量化法の開発」の２項目を行うことであった。「１．超解像顕微鏡の開発構築」に関しては、１分子FRET・１分子イメージング同時使用可能と、厚みのある細胞核観察対応を実現できる仕様をもった、生細胞多色１分子イメージング超解像顕微鏡を設計開発し、高画質化と高時間分解能を中心に、構築を行った。「２．解析法と定量化法の開発」に関しては、10 nm解像定量を行うとめの解析方法の開発と、10 nm精度の検証評価可能な、多色超解像ナノ解析法と定量化法のハード系・ソフト系を開発構築を行った。いずれも順調に進展している。さらに計画を前倒しで、「クロマチン構造変化の可視化と計測」「機能的クロマチン相互作用の可視化と定量」に関しても新学術領域内の共同研究により推進した。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．生細胞多色１分子イメージング超解像顕微鏡の開発と改良。これまでに開発構築してきたクロマチン動作原理解明のための超解像顕微鏡システムの改良を、高画質化・多自由度化・多色同期化を中心に、さらに進める。 ２．多色超解像ナノ解析法の開発と定量化法の開発と改良。引き続き、昨年度に引き続き、多色同期イメージング画像を用いて、10 nm分解能で生細胞における分子間距離を定量する方法と、そのための解析ソフトウェアシステムを改良する。ハード系・ソフト系を総合した精度が実際に10 nmあるかの評価検証を進める。 ３．クロマチン構造変化の可視化と計測。 DNA両末端を異なる波長で蛍光標識した再構成クロマチンを用いて、多色超解像ナノ解析を用い、動的クロマチン構造変化を可視化し定量する。 ４．機能的クロマチン相互作用の可視化と定量。 ヒストンバリアントをGFP標識し、生細胞において、２色同時１分子メージングあるいは超解像イメージングを行い、相互作用によるクロマチン動態変化を定量解析する。 ５．クロマチンと相互作用する核内複合体の細胞核内ダイナミクスの可視化と定量。クロマチンと相互作用するリモデリング複合体構成分子の生細胞における動態を、上記手法を用いて解析する。 ６．クロマチン動的構造の物理的要因と、生命機能発現における役割の解明。 クロマチン動的構造解析のために、DNA２重鎖構造の１分子力学計測および分子動力学による解析をエントロピーに焦点をあてで行う。
［連携研究者］
東京工業大学・大学院生命理工学研究科 十川久美子 多色蛍光標識分子導入細胞群の構築と観察解析
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Research Products
(18 results)
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[Journal Article] Regulation of RNA polymerase II activation by histone acetylation in single living cells2014
Author(s)
Stasevich TJ, Hayashi-Takanaka Y, Sato Y, Maehara K, Ohkawa Y, Sakata-Sogawa K, Tokunaga M, Nagase T, Nozaki N, McNally JG, Kimura H
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Journal Title
Nature
Volume: 516
Pages: 272-275
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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