ncRNA作動エレメントの配列構造の同定

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Neo-taxonomy of noncoding RNAs
• Project/Area Number: 26113002
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 廣瀬 哲郎 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 教授 (30273220)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 富田 耕造 国立研究開発法人産業技術総合研究所, ﾊﾞｲｵﾒﾃﾞｨｶﾙ研究部門, 研究員 (00345274)
• Project Period (FY): 2014-07-10 – 2019-03-31
• Keywords: 遺伝子 / ゲノム / 発現制御 / 細胞 / 生体分子

Outline of Annual Research Achievements

細胞内に存在する顆粒状構造体は、特定のノンコーディングRNA(lncRNA)を骨格として形成されるものが知られている。本研究では、この構造体の形成を担うlncRNA（=arcRNA）が、どのようなメカニズムでこの機能を発揮しているのかを明らかにすることを目標にしている。廣瀬は、核内構造体パラスペックルの骨格として働くNEAT1 lncRNAの構造形成に重要な配列要素（＝作動エレメント）を同定するために、ゲノム編集技術を用いて、ヒト培養細胞においてゲノム中のNEAT1を効率よく変異導入する系を確立した。このために２つのガイドRNAとCas9ヌクレアーゼを一体化した発現ベクターを、ヒトのハプロイド細胞株HAP1に導入して、目的とする領域が欠失したNEAT1変異体を有する細胞株を効率よく樹立できるようになった。またNEAT1以外のarcRNA探索のためにヒトタンパク質ー蛍光タンパク質発現ライブラリーによって可視化した核内fociの中からRNase感受性であるものをスクリーニングし、複数のRNase感受性核内構造体を発見した。そのうちSNBと呼ばれる核内構造体の新しい構成因子を複数同定し、その中からパラスペックルと同様にプリオン様ドメインに依存して構造体形成に関わるHNRNPDを同定した。分担者の富田は、上記SNBの構成因子の組換えタンパク質の発現系を作り、結晶化を試行している。さらに核内U6 ncRNAの3'末端成熟化に関わるポリU付加酵素の結晶化に成功し構造解析を開始した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでのarcRNA機能を支えるタンパク質因子について、複数の新たな情報を得ることが出来ただけでなく、arcRNAであるNEAT1 lncRNA自身の作動エレメント同定のためにキーとなるゲノム編集による変異体作成系が本格的に稼働し始めたことは、本研究を実施する上で大きな一歩であるといえる。NEAT1以外の新しいarcRNA同定に向けた探索研究でも重要な成果が得られ始めている。

Strategy for Future Research Activity

今年度稼働し始めたゲノム編集によるlncRNAの変異体作成解析を効率よくすすめて、世界でも例のない作動エレメントの同定にむけた解析を加速したいと考えている。またこれまで蓄積したタンパク質因子とlncRNA作動エレメントとの関連付けを行うために、PAR-CLIP情報を精査して各因子のlncRNA結合配列の情報を統合することが必要であると考えている。また新しいarcRNAについてもパートナーとなるタンパク質の情報を含めた解析を推進する。特にノンカノニカルなRNA結合因子については、構造解析を行う分担研究者と連携してそのRNA結合様式の研究も含めて実施していく。

Research Products

• [Int'l Joint Research] CNRS(フランス)
  • Country Name: FRANCE
  • Counterpart Institution: CNRS
• [Int'l Joint Research] 西オーストラリア大学(オーストラリア)
  • Country Name: AUSTRALIA
  • Counterpart Institution: 西オーストラリア大学
• [Int'l Joint Research] VIB(ベルギー)
  • Country Name: BELGIUM
  • Counterpart Institution: VIB
• [Journal Article] Genome-wide co-localization screening of nuclear body components using a fluorescently tagged FLJ cDNA clone library. (2015)
  • Author(s): Hirose, T., Goshima, N
  • Journal Title: Methods Mol. Biol. Volume: 1262 Pages: 155-163
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-2253-6_9.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Rapid and Efficient Elimination of Specific Nuclear Noncoding RNAs in Mammalian Cells with Antisense Oligonucleotides. (2015)
  • Author(s): Hirose, T., Mannen, T.
  • Journal Title: Methods Mol. Biol. Volume: 1206 Pages: 149-156
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-1369-5_13
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] The lncRNA Neat1 is required for corpus luteum formation and the establishment of pregnancy in a subpopulation of mice. (2014)
  • Author(s): Nakagawa, S., Shimada, M., Yanaka, K., Mito, M., Arai, T., Takahashi, E., Fujita, Y., Fujimori, T., Standaert, L., Marine, J.C., Hirose, T.
  • Journal Title: Development Volume: 141 Pages: 4618-4627
  • DOI: 10.1242/dev.110544
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] The long noncoding RNA Neat1 is required for mammary gland development and lactation. (2014)
  • Author(s): Standaert, L., Adriaens, C., Radaelli, E., Van Keymeulen, A., Blanpain, C., Hirose, T., Nakagawa, S., Marine, J.C.
  • Journal Title: RNA Volume: 20 Pages: 1844-1849
  • DOI: 10.1261/rna.047332.114
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The Estrogen receptor alpha regulated lncRNA NEAT1 is a critical modulator of prostate cancer. (2014)
  • Author(s): Chakravarty, D., Sboner, A., Nair, S., Giannopoulou, E., Li, R., Hennig, S., Mosquera, J.M., Pauwels, J., Park, K., Kossai, M., MacDonald, T., Fontugne, J., Erho, N., Vergara, I., Ghadessi, M., Davicioni, E., Jenkins, R., Palanisamy, N., Chen, Z., Nakagawa, S., Hirose, T., et al.
  • Journal Title: Nat Commun Volume: 5 Pages: 5383
  • DOI: 10.1038/ncomms6383
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Molecular insights into replication initiation by Qβ replicase using ribosomal protein S1 (2014)
  • Author(s): Takeshita D, Yamashita S, Tomita K
  • Journal Title: Nucleic Acids Res Volume: 42 Pages: 10823-10831
  • DOI: 10.1093/nar/gku745
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structures and Functions of Qβ Replicase: Translation factors beyond protein synthesis. (2014)
  • Author(s): Tomita K
  • Journal Title: Int. J. Mol. Sci Volume: 15 Pages: 15552-15570
  • DOI: 10.3390/ijms150915552
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Molecular mechanism of template-independent CCA-addition (2015)
  • Author(s): 富田耕造
  • Organizer: Joint Australa and Japan RNA meeting 2014
  • Place of Presentation: Sydney, Australia
  • Year and Date: 2015-11-03 – 2015-11-05
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Regulation of Poly (U) Polymerase by ADP-ribosylation (2015)
  • Author(s): 長永池崇、富田 耕造
  • Organizer: Joint Australa and Japan RNA meeting 2014
  • Place of Presentation: Sydney, Australia
  • Year and Date: 2015-11-03 – 2015-11-05
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Molecular basis for CC-addition by Aquifex aeolicus CC-adding enzyme (2015)
  • Author(s): 山下征輔、富田 耕造
  • Organizer: 25th tRNA Conference
  • Place of Presentation: Kyllini Pelopponese, Greece
  • Year and Date: 2015-09-21 – 2015-09-25
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] RNA機能と神経変性 (2015)
  • Author(s): 廣瀬哲郎
  • Organizer: 日本神経学会北海道地区生涯教育講演会
  • Place of Presentation: 北海道大学医学部（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-03-08
  • Invited
• [Presentation] Search for RNA-dependent subnuclear structures in mammalian cells (2014)
  • Author(s): 廣瀬哲郎
  • Organizer: Tokyo RNA Club
  • Place of Presentation: 東京大学武田ﾎｰﾙ（東京都文京区）
  • Year and Date: 2014-11-28
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] The possible common mechanism underlying assembly of the nuclear bodies on architectural long noncoding RNAs (2014)
  • Author(s): 廣瀬哲郎
  • Organizer: Joint Australa and Japan RNA meeting 2014
  • Place of Presentation: Sydney, Australia
  • Year and Date: 2014-11-03 – 2014-11-05
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] The common mechanism underlying assembly of the nuclear granules on the architectural noncoding RNAs (2014)
  • Author(s): 廣瀬哲郎
  • Organizer: ESF/EMBO Conference
  • Place of Presentation: Polonia Castle, Poland
  • Year and Date: 2014-09-13 – 2014-09-18
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 細胞内構造構築を担うlncRNAの作用機序と関連疾患 (2014)
  • Author(s): 廣瀬哲郎
  • Organizer: 第157回日本獣医学会学術集会（シンポジウム）
  • Place of Presentation: 北海道大学高等教育推進機構（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2014-09-09 – 2014-09-12
  • Invited
• [Presentation] Architectural noncoding RNAによる細胞内構造構築の分子機構とその意義 (2014)
  • Author(s): 廣瀬哲郎
  • Organizer: 第５１回日本生化学会北海道支部例会
  • Place of Presentation: 北海道大学百年記念会館（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2014-07-18
  • Invited