2014 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Neo-taxonomy of noncoding RNAs |
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| Project/Area Number |
26113007
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
泊 幸秀 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 教授 (90447368)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
多田隈 尚史 京都大学, 学内共同利用施設等, 研究員 (10339707)
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| Project Period (FY) |
2014-07-10 – 2019-03-31
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| Keywords | 一分子観察 / Argonaute / siRNA / RISC |
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| Outline of Annual Research Achievements |
siRNA作動装置であるRISCの形成過程を一分子レベルで解析するため、siRNA二本鎖のそれぞれの鎖を蛍光色素で標識し、ガラス基板上に固定したAgo2に対し、RISC形成に必要な因子群を再構成した上で、siRNAのAgo2への結合解離の様子を詳細に観察した。種々の検討を重ねた結果、ガラス基板上において、一分子レベルでRISC形成過程を正しく観察することに世界で初めて成功した。興味深いことに、Dicer-2/R2D2非存在下においては、siRNA二本鎖はAgo2に結合できないのに対し、Dicer-2/R2D2存在下では、siRNAはAgo2に対して「短い結合」を行うことが明らかとなった。ただしこの短い結合はRISC形成には不十分であり、Dicer-2/R2D2に加えてシャペロン因子群を加えたときに観察される「長い結合」が起こって初めて、siRNAはAgo2に正しく取り込まれ、その後さらに片側の鎖が捨てられることによって、成熟体RISCが作られるということが分かった。このシャペロン因子群による効果は、従来の生化学実験では判明し得なかった重要な知見であり、論文としてNature誌に報告した。
また、形成されたRISCが、相補的な標的RNAを認識、切断、解離する様子についても、一分子観察を行った。その結果、RISC内のsiRNAガイド鎖の「Seed領域」と呼ばれる5'末端側の領域は、切断する標的RNAとすばやく結合する役割があり、「3' Supplementary領域」と呼ばれる逆側の領域は、正しい標的RNAであるかをさらに確認する校正機能があるということの直接的証拠を示し、Molecular Cell誌に報告した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
基板上でRISC形成を再構成し、その一分子レベルでの解析に世界に先駆けて成功したことは、特筆すべき成果である。これまでの生化学では限界に達していたRISC形成過程の解析に新たな方向性を提示する結果となった。また、RISC形成過程だけではなく、形成された後のRISCが、どの様にして標的を認識、切断、解離するのかという点についても一分子レベルでの解析に成功し、当初の計画以上の進展を得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
RISC形成過程については、これまではsiRNA二本鎖に蛍光色素を導入した実験を行ってきたが、今後は、Ago2やDicer-2/R2D2あるいはシャペロン因子群などのタンパク質因子に蛍光を導入し、それぞれのタンパク質とsiRNAとの位置関係を含めた解析を行いたい。
また、標的の認識、切断、解離についても、RNAサイレンシングを阻害することが知られているウィルス由来のサイレンシングサプレッサータンパク質などを利用し、より詳細な解析を進めたい。
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