2016 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Neo-taxonomy of noncoding RNAs |
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| Project/Area Number |
26113007
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
泊 幸秀 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 教授 (90447368)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
多田隈 尚史 大阪大学, 蛋白質研究所, 助教 (10339707)
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| Project Period (FY) |
2014-07-10 – 2019-03-31
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| Keywords | Argonaute / RISC / 一分子イメージング / small RNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度に確立した、昆虫細胞を用いてnon-coding RNA関連タンパク質因子を発現させ、蛍光色素を導入して精製する手法を活用し、蛍光色素で標識したArgonauteタンパク質や、Dicer-2/R2D2ヘテロダイマーなどを十分な量および精製度で調整することに成功し、これらを用いた各種経路の一分子解析系の構築を進めた。また、Argonauteタンパク質に2色の蛍光色素を導入し、その蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を観察することで、構造変化を追跡する実験系の開発に着手した。この目的のためには、これまで用いてきたHaloあるいはSNAPタグを用いた蛍光色素導入法では限界があるため、システイン残基を利用した古典的な蛍光色素導入法に加え、非天然アミノ酸の部位特異的導入法やin vitroでのタンパク質合成系など、様々な方法を比較検討し、効率よく蛍光色素を導入できる手法の開発を進めた。
また、すでに確立したRISCによる標的切断過程の一分子イメージング系を用い、様々なウィルスが持つサイレンシングサプレッサータンパク質が標的切断過程を阻害する様式を詳細に解析した。具体的には、フロックハウスウイルスのB2タンパク質、ショウジョウバエCウイルスの1Aタンパク質、コオロギ麻痺ウイルスの1Aタンパク質をリコンビナントタンパク質として調製し、ショウジョウバエAgo2-RISCによる標的RNA切断の一分子イメージング系に導入した後、全反射顕微鏡を用いてその様子をリアルタイムでモニターすることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
蛍光色素を導入した各種タンパク質を用いた一分子イメージングを安定的に行える体制がととのったことにより、現在焦点を当てている小分子RNA経路の解析が今後順調に進むことが予想されるとともに、他のnon-coding RNA作動装置の一分子イメージングに対象を広げることが可能であることを意味している。また、1つのタンパク質に複数の蛍光色素を導入する手法の検討においては良好な予備データを得ており、今後、各種non-conding RNA関連タンパク質の構造変化をモニターできる系の構築に向けて期待できる。さらには、ウイルスがもつサイレンシングサプレッサータンパク質の詳細な一分子イメージング解析にも成功しており、研究全体としては概ね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、蛍光色素を導入したArgonauteタンパク質や、Dicer-2/R2D2ヘテロダイマーなどを用いた小分子RNA経路の一分子解析を積極的に進め、生化学では難しい分子メカニズムの解明に迫りたいと考えている。また、Zero-Mode Waveguide (ZMW)を含めた一分子イメージングの系そのものの改良を進め、解析対象となりうる分子や濃度範囲の幅を広げることにより、領域で扱われている様々なnon-coding RNAの一分子解析に資する体制を整えたい。
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