2014 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Cell competition: a mechanism for survival of the fittest in the multi-cellular community |
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| Project/Area Number |
26114009
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
一條 秀憲 東京大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (00242206)
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| Project Period (FY) |
2014-07-10 – 2019-03-31
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| Keywords | 細胞競合 / ゲノムワイドsiRNAスクリーニング / Scribble / ASK1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は哺乳類細胞において細胞競合を司る分子メカニズムをストレス応答の観点から明らかにすることである。平成26年度は当初の計画どおりに、(1)ゲノムワイドsiRNAスクリーニングによる網羅的アプローチ、および(2)既知のストレス応答分子の関与の検討を中心としたCandidateアプローチに関して検討を行った。
(1)については、哺乳類の培養細胞系の細胞競合を全自動イメージアナライザーで解析する系の構築を試みた。スクリーニングは大量のサンプルを扱うことになるため、細胞競合現象を迅速かつ客観的に評価する系が必須となる。我々は画像から細胞を規定し、その個々の細胞の蛍光強度を測ることで、蛍光を持つ細胞と持たない細胞、それぞれの細胞数を計測するようなシステムを構築した。実際に領域代表者の藤田が開発したMDCK細胞のScribble欠損による細胞競合モデルをこのシステムで解析した。GFPを発現するテトラサイクリン誘導性Scribble欠損細胞とGFPを発現しない正常細胞を前述した方法で区別し、それぞれの数を数えたところ、テトラサイクリンによる変異誘導時にScribble欠損細胞の数が減るという細胞競合で見られる現象が観察された。我々が所有するsiRNAライブラリーはヒトまたはマウスのゲノムを対象にしたものなので、現在ヒトまたはマウスの培養細胞の細胞競合のモデルを作製中である。
(2)については、MDCK細胞でScribble欠損による競合モデルに関して、阻害剤およびsiRNAを用いてASKファミリー分子およびその下流で働くストレス応答性MAPKの寄与を検証した。ASKファミリーおよびp38の阻害剤の処置および、ASK1の発現抑制によって程度は低いながらもScribble欠損細胞の数の減少が見られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は全自動イメージアナライザーで細胞競合を客観的に評価する系の構築をすることができた。この評価系はゲノムワイドsiRNAスクリーニングを迅速かつ客観的に行う上で欠かせない系であるため、この系の構築ができたことは計画のsiRNAスクリーニング系の構築が順調に進んでいることを示している。また、この系をCandidateアプローチにも使用し、ASKファミリーおよびp38のScribble欠損による細胞競合に関与していることを示唆できた。以上のことから計画がおおむね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
ゲノムワイドsiRNAスクリーニングに関しては前述した通り、我々が保有するゲノムワイドsiRNAライブラリーに適用できるヒトまたはマウスの培養細胞の細胞競合モデルを作製する。具体的には、MDCK細胞において自動イメージアナライザーで検出することに成功した、恒常的にGFPを発現し、テトラサイクリン誘導性にshRNAを発現させることでScribbleをノックダウンできる細胞の作製をすでに始めている。作製した細胞で、細胞競合が観察され、条件検討によって系の安定性を高め、スクリーニングを行う予定である。ゲノムワイドのスクリーニングはハイスループット性を保ったまま行うために、正常細胞とテトラサイクリン誘導性Scribble欠損細胞の両者をsiRNAが配置されたwellで混合培養して行う予定である。
Candidateアプローチに関しては近年、細胞競合に関わることが報告されたASKファミリーの上流で活性制御を行うSARMがASKファミリーの活性制御を介して細胞競合に関与しているかどうか検討する。また、Scribbleの欠損によって起こる細胞競合がどのような細胞死を介して起こっているかに関しても検討する。現在までの解析でアポトーシス阻害剤の処置によってScribble欠損細胞の細胞死が抑制されないことから、ASK1-p38経路の関与が報告されているネクローシスの可能性などを検証する。
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[Journal Article] The ASK family kinases differentially mediate induction of type I interferon and apoptosis during the antiviral response.2015
Author(s)
Okazaki, T., Higuchi, M., Takeda, K., Iwatsuki-Horimoto, K., Kiso, M., Miyagishi, M., Yanai, H., Kato, A., Yoneyama, M., Fujita, T., Taniguchi, T., Kawaoka, Y., Ichijo, H. and Gotoh, Y.
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Journal Title
Sci. Signal.
Volume: 8
Pages: ra78
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Roquin-2 promotes ubiquitin-mediated degradation of ASK1 to regulate stress responses.2014
Author(s)
Maruyama, T., Araki, T., Kawarazaki, Y., Naguro, I., Heynen, S., Aza-Blanc, P., Ronai, Z., Matsuzawa, A. and Ichijo, H.
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Journal Title
Sci. Signal.
Volume: 7,
Pages: ra8
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] ASK1 promotes the contact hypersensitivity response through IL-17 production.2014
Author(s)
Mizukami, J. Sato, T., Camps, M., Ji, H., Rueckle, T., Swinnen, D., Tsuboi, R., Takeda, K. and Ichijo, H.
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Journal Title
Sci. Rep.
Volume: 4
Pages: 4714
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] The DEAH-Box RNA Helicase DHX15 activates NF-κB and MAPK signaling downstream of MAVS during antiviral responses.2014
Author(s)
Mosallanejad, K., Sekine, Y., Ishikura-Kinoshita, S., Kumagai, K., Nagano, T., Matsuzawa, A., Takeda, K., Naguro, I. and Ichijo, H.
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Journal Title
Sci. Signal.
Volume: 7
Pages: ra40
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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