2014 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Nascent-chain Biology |
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| Project/Area Number |
26116006
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
河野 憲二 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (50142005)
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| Project Period (FY) |
2014-07-10 – 2019-03-31
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| Keywords | 翻訳停止 / mRNAの局在化 / 小胞体ストレス応答 / リボソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. 翻訳アレストによるXBP1u mRNAの小胞体膜への標的化機構の解明
XBP1u蛋白質のN末側にFlagの配列を付加したFlag-XBP1uをHEK293細胞に発現し，抗Flag抗体による免疫沈降実験，さらに質量分析を行ったところ、シグナル認識粒子(SRP)の成分であるSRP54，SRP72，また、トランスロコンの成分であるSec61などが共沈降してきた。このことは、XBP1uが分泌経路を利用して小胞体膜に運ばれていることを示している。XBP1uは翻訳の一過的停止を起こし、S255A変異(XBP1u(S255A))はさらに強固な翻訳停止を、一方W256A変異(XBP1u(W256A))は翻訳停止を起こさないことを既に報告している。そこでこれらの変異型XBP1uを用いて更なる検討を行った。野生型及び変異型のXBP1uを細胞に発現し，XBP1uで共沈降すると、翻訳停止の強さに比例してSRP54, Sec61を沈降するが、XBP1u(W256A)では両蛋白質との結合がみられないことが明らかとなった。このことは、翻訳の停止に依存して分泌経路を利用していることを示唆している。次年度は，SRPを殆ど含まない小麦胚芽抽出液(WGE)を用いた無細胞蛋白質合成系に膜画分を加え、精製したSRP添加に依存してXBP1uが膜画分に運ばれることを証明する計画である。
2. 翻訳アレストの分子機構の解析
S255A変異は翻訳アレストが増強しているので、このアミノ酸を他の18のアミノ酸すべてに変換して，翻訳アレストの強さを比較したところ、S255A>S(野生型)＝S255G>>他の17アミノ酸 という結果になり、側鎖の小さいアミノ酸が翻訳停止を起こす傾向が認められた。調べた限りでは、255番目のアミノ酸変異だけが、翻訳停止活性を増強するので、その理由について検討を加える。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
XBP1u mRNAがXBP1uの翻訳停止に依存して，小胞体膜上に移動する可能性をサポートするデータを得ることができ、本年度の計画通り順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 翻訳アレストによるXBP1u mRNAの小胞体膜への標的化機構の解明
SRPを殆ど含まない小麦胚芽抽出液(WGE)を用いた無細胞蛋白質合成系に膜画分を加え、精製したSRP添加に依存してXBP1uが膜画分に運ばれることを証明する。 小胞体ターゲティングシグナルをもつHR2領域を欠失したXBP1u（dHR2）ではXBP1u mRNAを小胞体膜上に運ぶ効率が落ちること、またXBP1u mRNAの特殊スプライシング効率が落ちることを明らかにする。
2. 翻訳アレストの分子機構の解析
①生化学的アプローチ： HR2領域が相互作用する分子を光架橋や共免疫沈降により取得し，質量分析などの方法によりそれらの分子を同定する。
②遺伝学的アプローチ： ヒト由来のハプロイド細胞（KBM7細胞にスクリーニング用のレポーター遺伝子を発現させた安定発現細胞を取得後、gene-trap mutagenesisによる遺伝子ノックアウトスクリーニングにより翻訳アレストが解除された細胞を選択し、その遺伝子を同定することを目的とする。スクリーニング系の確立を引き続き目指す。
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[Journal Article] Tight regulation of the unfolded 1 protein sensor Ire1 by its intramolecularly antagonizing subdomain.2015
Author(s)
Mathuranyanon, R., Tsukamoto, T., Takeuchi, A., Ishiwata-Kimata, Y., Tuchiya, Y., Kohno, K., and Kimata, Y
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Journal Title
Journal of Cell Science
Volume: in press
Pages: in press
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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