mRNAの局在化に働く新生鎖の機能解析

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Nascent-chain Biology
• Project/Area Number: 26116006
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 河野 憲二 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (50142005)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木俣 行雄 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 准教授 (60263448)
• Project Period (FY): 2014-07-10 – 2019-03-31
• Keywords: 蛋白質 / 翻訳休止 / 小胞体ストレス応答 / 新生鎖

Outline of Annual Research Achievements

本研究は，翻訳休止（ポージング）により起こる，翻訳途上蛋白質とリボソームの品質管理機構，また翻訳レベルでの新生鎖とリボソームの生理機能について明らかにすることを目的とする。モデル蛋白質として，哺乳動物細胞の小胞体ストレス応答に重要なXBP1uの翻訳休止によるXBP1u mRNAの小胞体膜への輸送機構を解明する。小胞体膜への輸送のためには、「疎水性領域(HR2)と翻訳休止配列（PS）の2つが必要であり、翻訳休止時にHR2にシグナル識別粒子(SRP)が結合することが重要であること」が今までの研究で明らかになっている。今回の実験で、PSのC末側1つ目のアミノ酸Asnを削除しても良いが、2つ目のアミノ酸Metを削除すると翻訳休止を起こさないことが明らかとなった。このことは翻訳休止時にMetがリボソーム上のP siteに位置していることが翻訳休止に必要であるという今までのデータを支持している。また合成途上のXBP1uを小胞体膜上へ特異的に運ぶためには，HR2とPSとの適正な距離（アミノ酸残基数）が重要であることを示唆する結果を得た。XBP1uは小胞体膜上に運ばれるが、膜内に挿入されないことがその機能に必要であることを考えると、現在のように出口から少し離れた距離にあることに何らかの重要な意味があると考えている。このことは逆に，分泌蛋白質の効率よい小胞体膜通過を解析するための良いモデルとなる可能性を秘めている。また翻訳休止時に新生鎖とリボソーム蛋白質とが相互作用していることが考えられていたが、光架橋法によりRPL3,4,7がその候補蛋白質として上がって来た。これらの蛋白質はリボソームトンネル内に露出することが報告されているので、翻訳休止に必要なアミノ酸がこれらのリボソーム蛋白質と相互作用していると考えられる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

（1）翻訳休止によるXBP1u mRNAの小胞体膜への標的化機構の解明　①　XBP1u新生鎖の翻訳休止に必要なC末側26アミノ酸残基（PS）をC末側から1アミノ酸ずつ削除したmRNAを作製しin vitroで翻訳した結果、C末端側から2番目のMet まで削ると翻訳休止がほとんど起きないことが分かり、翻訳休止が起きるためにはMet がPサイトに位置していることが重要であることが支持された。②　HR2-PS間のアミノ酸を5, 10, 15, 27残基削除した変異型XBP1uを発現させ、その翻訳休止や膜への挿入効率を調べた所、膜への挿入効率は5－15アミノ酸を削除するに従い上昇する傾向が観察された。これは，新生鎖のHR2がリボソームから丁度出現した位置にあることが膜への挿入効率を挙げていることを示唆している。しかし翻訳休止効率も落ちているため、より詳細な検討が必要である。
（2）翻訳休止の分子機構の解析　 ①光架橋の実験から，翻訳休止配列のアミノ酸がリボソーム蛋白質のRPL3, RPL4, RPL7と相互作用していることを支持する結果を得た。これらのリボソーム蛋白質は，ペプチド鎖合成のリボソームトンネルに露出していることが報告されており、翻訳休止配列との相互作用を支持する結果である。

Strategy for Future Research Activity

（1）XBP1uの小胞体膜へのリクルートには、翻訳休止とHR2にSRPが結合することが重要であることが明らかとなっている。今回の研究からHR2とPSとの間の距離が小胞体膜への挿入効率に影響することが分かった。短くすると効率が上がることが示されたが，その理由としては2つの可能性が考えられる。1つはHR2がリボソームトンネル外に丁度露出する位置にあることがSRPの結合に重要である可能性、もう1つは翻訳休止が膜への挿入を抑制している可能性である。今後はそれらのdeletion mutantsとSRP54との結合量、また膜への挿入効率や翻訳休止効率の変化をより詳細に調べどちらの可能性が正しいのかを明らかにする。
（2）リボソーム蛋白質のRPL3, 4, 7とXBP1uのPSとの相互作用が示唆されたので、これらのRPLの発現をノックダウンした時に、XBP1uの翻訳休止が減少するかどうかを調べる。翻訳休止が減少するという実験結果が得られたならば、これらのRPL蛋白質を過剰発現させ翻訳休止のrescue 実験を行なう。この系が動くことが確認されれば、RPLのアミノ酸部位に変異を入れたRPLを発現させ、相互作用するアミノ酸部位を同定したい。また共免疫沈降の実験から，翻訳休止を起こす時にリボソーム上での相互作用を起こす蛋白質の1つとしてeEF2が候補に上がって来た。eEF2に関しては，ジフタマイドと呼ばれる特殊な修飾アミノ酸の生理的役割に着目し、翻訳休止との関連を調べたい。

Research Products

• [Int'l Joint Research] UCSF(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: UCSF
• [Journal Article] 4μ8C inhibits insulin secretion independent of IRE1α RNase activity. (2017)
  • Author(s): Sato, H., Shiba, Y., Tsuchiya, Y., Saito, M., Kohno, K.
  • Journal Title: Cell Structure and Function Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1247/csf.17002
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Ptf1a+, ela3l- cells are developmentally maintained progenitors for exocrine regeneration following extreme loss of acinar cells in zebrafish larvae. (2017)
  • Author(s): Schmitner, N., Kohno, K., Meyer, D.
  • Journal Title: Dis. Model Mech. Volume: 10 Pages: 307-321
  • DOI: 10.1242/dmm.026633.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Defective ATG16L1-mediated removal of IRE1α drives Crohn’s disease-like ileitis. (2017)
  • Author(s): Tschurtschenthaler, M., Adolph, T.E., Ashcroft, J.W., Niederreiter, L., Bharti, R., Saveljeva, S., Bhattacharyya, J., Flak, M.B., Shih, D.Q., Fuhler, G.M., Parkes, M., Kohno, K., Iwawaki, T., van der Woude, C.J., Harding, H., Smith, Peppelenbosch, M.P., Targan, S.R., Ron, D., Rosenstiel, P., Blumberg, R.S., Kaser, A.
  • Journal Title: J. Exp. Med. Volume: 214 Pages: 401-422
  • DOI: 10.1084/jem.20160791.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Autonomous translational pausing is required for XBP1u mRNA recruitment to the ER via the SRP pathway. (2016)
  • Author(s): Kanda, S., Yanagitani, K., Yokota, Y., Esaki, Y., Kohno, K.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Volume: 113 Pages: E5885-E5895
  • DOI: 10.1073/pnas.1604435113
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Cadmium impairs protein folding in the endoplasmic reticulum and induces the unfolded protein response. (2016)
  • Author(s): Le, Q.G,, Ishiwata-Kimata, Y., Kohno, K. Kimata, Y.
  • Journal Title: FEMS Yeast Research Volume: pii: fow049 Pages: 1-8
  • DOI: 10.1093/femsyr/fow049
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Novel mechanism of enhancing IRE1α-XBP1 signalling via the PERK-ATF4 pathway. (2016)
  • Author(s): Tsuru, A., Imai, Y., Saito, M., Kohno, K.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 6 Pages: 24217(1-8)
  • DOI: 10.1038/srep24217
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 膵島β細胞における阻害剤をもちいたIRE1αの機能解析 (2017)
  • Author(s): 佐藤仁美
  • Organizer: 日本農芸化学会2017年度大会
  • Place of Presentation: 京都女子大(京都府・京都市)
  • Year and Date: 2017-03-17 – 2017-03-20
• [Presentation] 小胞体ストレス応答に関与するXBP1uがSRP経路にはいるための条件解析 (2017)
  • Author(s): 桶谷真希
  • Organizer: 日本農芸化学会2017年度大会
  • Place of Presentation: 京都女子大(京都府・京都市)
  • Year and Date: 2017-03-17 – 2017-03-20
• [Presentation] ペプチド鎖伸長因子2に形成されるジフタミドの生理的意義の解明 (2016)
  • Author(s): 小池雅昭
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] ジフタミド修飾酵素欠損細胞を用いたジフタミドの生理的意義の解明 (2016)
  • Author(s): 山田麗奈
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] 膵臓β細胞におけるIRE1α-XBP1 経路の生理的活性化はプロインスリン折り畳み酵素の発現維持に働く (2016)
  • Author(s): 土屋雄一
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] The role of translational pausing in the delivery of XBP1u mRNA to the ER via the SRP pathwa (2016)
  • Author(s): Kenji Kohno
  • Organizer: EMBO conferences “Structure and function of the endoplasmic reticulum”
  • Place of Presentation: PGA Cataluna Resort (Girona, Spain)
  • Year and Date: 2016-10-23 – 2016-10-27
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Novel physiological roles of RQC in the ER of mammalian cells. (2016)
  • Author(s): Ash-way Sogawa
  • Organizer: EMBO conferences “Structure and function of the endoplasmic reticulum”
  • Place of Presentation: PGA Cataluna Resort (Girona,Spain)
  • Year and Date: 2016-10-23 – 2016-10-27
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 膵特異的に発現するPDIファミリータンパク質(PDIp)の生理的な機能の解析 (2016)
  • Author(s): 藤本拓志
  • Organizer: 第８９回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 東北大学川内北キャンパス(宮城県・仙台市)
  • Year and Date: 2016-09-25 – 2016-09-27
• [Presentation] Autonomous translational pausing is required for XBP1u mRNA recruitment to the ER via the SRP pathway (2016)
  • Author(s): Kenji Kohno
  • Organizer: Nascent Chain Biology International Symposium
  • Place of Presentation: Fuji Lake Hotel(山梨県・南都留郡)
  • Year and Date: 2016-09-01 – 2016-09-03
  • Invited
• [Presentation] Studies on physiological meanings of diphthamide in eEF2 (2016)
  • Author(s): Masaaki Koike
  • Organizer: Nascent Chain Biology International Symposium
  • Place of Presentation: Fuji Lake Hotel(山梨県・南都留郡)
  • Year and Date: 2016-09-01 – 2016-09-03
• [Presentation] Molecular mechanism of XBP1u translational pausing (2016)
  • Author(s): Miku Ohfurudono
  • Organizer: Nascent Chain Biology International Symposium
  • Place of Presentation: Fuji Lake Hotel(山梨県・南都留郡)
  • Year and Date: 2016-09-01 – 2016-09-03
• [Presentation] Novel physiological roles of RQC in the ER of mammalian cells (2016)
  • Author(s): Ash-way Sogawa
  • Organizer: Nascent Chain Biology International Symposium
  • Place of Presentation: Fuji Lake Hotel(山梨県・南都留郡)
  • Year and Date: 2016-09-01 – 2016-09-03
• [Presentation] The Unfolded Protein Response in Yeast Cells under Stationary Phase (2016)
  • Author(s): Tran Minh Duc
  • Organizer: 第68回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: 京都テルサ（京都府・京都市）
  • Year and Date: 2016-06-15 – 2016-06-17
• [Presentation] Hanging Drop法による膵臓β細胞株を用いたpseudoisletの作製 (2016)
  • Author(s): 土屋雄一
  • Organizer: 第68回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: 京都テルサ（京都府・京都市）
  • Year and Date: 2016-06-15 – 2016-06-17
• [Presentation] ペプチド鎖伸長因子2に形成されるジフタミドの生理的意義の解明 (2016)
  • Author(s): 小池雅昭
  • Organizer: 第68回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: 京都テルサ（京都府・京都市）
  • Year and Date: 2016-06-15 – 2016-06-17
• [Presentation] ペプチド鎖伸長因子eEF2におけるジフタミド修飾の生理的意義の解明 (2016)
  • Author(s): 小池雅昭
  • Organizer: 「新生鎖の生物学」第3回若手ワークショップ
  • Place of Presentation: 淡路夢舞台国際会議場（兵庫県淡路市）
  • Year and Date: 2016-05-23 – 2016-05-25
• [Presentation] 新生鎖の品質管理機構RQCの小胞体に対する生理的役割 (2016)
  • Author(s): 曽川愛守榮
  • Organizer: 「新生鎖の生物学」第3回若手ワークショップ
  • Place of Presentation: 淡路夢舞台国際会議場（兵庫県淡路市）
  • Year and Date: 2016-05-23 – 2016-05-25
• [Presentation] A novel role of SRP pathway on XBP1u localization and ER homeostasis (2016)
  • Author(s): 苅田聡
  • Organizer: 「新生鎖の生物学」第3回若手ワークショップ
  • Place of Presentation: 淡路夢舞台国際会議場（兵庫県淡路市）
  • Year and Date: 2016-05-23 – 2016-05-25
• [Presentation] XBP1u タンパク質の翻訳停止機構の解明 (2016)
  • Author(s): 大古殿美加
  • Organizer: 「新生鎖の生物学」第3回若手ワークショップ
  • Place of Presentation: 淡路夢舞台国際会議場（兵庫県淡路市）
  • Year and Date: 2016-05-23 – 2016-05-25
• [Remarks] 動物細胞工学研究室（河野研）
  • URL: http://bsw3.naist.jp/kouno/
• [Remarks] 動物細胞工学研究室（河野研）
  • URL: https://www.facebook.com/naist.kohnolab/