2017 Fiscal Year Annual Research Report
Membrane topogenesis and quality control of tail-anchored proteins (TAs)
| Project Area | Nascent-chain Biology |
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| Project/Area Number |
26116007
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
藤木 幸夫 九州大学, 生体防御医学研究所, 特任教授 (70261237)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田村 茂彦 九州大学, 基幹教育院, 教授 (90236753)
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| Project Period (FY) |
2014-07-10 – 2019-03-31
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| Keywords | 新生鎖 / テイルアンカー型タンパク質 / オルガネラ選別輸送 / 膜挿入機構 / 品質管理機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
テイルアンカー型膜タンパク質(TA)は広く知られた翻訳共役輸送系に依らず、リボソームからサイトゾルへ放出された後に各オルガネラ膜へ直接輸送される。TA の細胞内選別輸送は、リボソームでの新生鎖翻訳時およびその直後から品質管理を伴いつつおきると考えられているが、その詳細は不明な点が多い。本研究では、TAをモデルとしたリボソーム翻訳時における新生鎖の運命決定機構およびオルガネラ選別輸送・膜挿入の分子機構を解明することを目的としている。
H29年度は、翻訳途上新生鎖TAの検出系を用いた解析およびBag6複合体 やPex19p等の既知TA輸送関連因子との結合解析等を行い、Pex26pなどペルオキシソーム局在性TAにおける翻訳遅延に関与する領域を同定し、TA輸送における役割について新たな知見を得た。また、先に同定したペルオキシソーム局在性TAと結合するサイトゾルタンパク質因子に関して、ゲノム編集技術により樹立したノックアウト細胞を用いた解析等により、これが新生鎖TAのペルオキシソーム輸送において品質管理に関与することを明らかにしつつある。
また関連した成果として、ミトコンドリア外膜局在性TAであるMitochondrial Rho GTPase-1（Miro1）に関し、私達は新たに２種のペルオキシソーム局在型ヒトMiro1スプライシングバリアント(Var2, Var4)を同定した。これらは、ペルオキシソーム膜タンパク質レセプターPex19pとの結合領域を含む挿入配列に依存してペルオキシソームへ輸送され、これまで未解明であった哺乳類ペルオキシソームの微小管依存的な細胞内長距離移動を担うことを発見し、国際誌J. Cell Biol.に発表した（Okumoto, K. and Fujiki, Y. et al.: J. Cell Biol., 217, 619-633, 2018）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新生鎖TAのペルオキシソーム選別輸送について、翻訳遅延がペルオキシソーム局在化効率を高めていることを見出しつつあり、その分子機構を詳細に検討している。また、新規に同定したペルオキシソームTA結合タンパク質因子について、ゲノム編集技術によりノックアウト細胞の樹立に成功し、Pex19pとの関連を含めた形でペルオキシソームTAの認識、輸送における役割を明らかにしつつある。さらにBag6複合体を介した小胞体局在性TAとの比較・検討により、新生鎖TA合成時におけるオルガネラ選別および品質管理システムについて新たな知見を得ている。また、上記研究実績に記したように、新たなペルオキシソーム局在性TAタンパク質であるMiro1スプライシングバリアント(Var2, Var4)の同定に成功し、哺乳類ペルオキシソームの微小管依存的な細胞内長距離移動の分子機構を明らかにした。同時に、スプライシングによる挿入配列に依存してTAの細胞内局在がミトコンドリアからペルオキシソームへ切り替わることも示しており、TAの選別輸送という観点からも新たな知見をもたらす重要な成果となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
① 新生鎖TAの認識および品質管理システムの解明
これまでに確立してきた無細胞翻訳系と中性条件下SDS-PAGEによる翻訳途上新生鎖TAの検出系を用いて、種々の改変型ペルオキシソーム局在性モデルTA の翻訳速度解析を行う。同義コドン置換の導入によりアミノ酸配列を変えずに翻訳速度が変動するモデルTA等を作製し、翻訳速度と細胞内局在の効率、品質管理との関連性を明らかにする。翻訳遅延を解消させたモデルTAは、野生型と比較してペルオキシソーム局在化効率が低下していることを示唆する結果を得ており、Pex19pによる認識、およびSGTAやBag6複合体の関与等の解析も併せて新生鎖TA の認識および翻訳速度調節を伴う品質管理システムを明らかにする。
② 新生鎖TAのオルガネラ選別輸送の解明
これまでの研究により、ペルオキシソーム局在性TAとPex19pの複合体に特異的に結合するサイトゾルタンパク質を同定しており、新生鎖TAのペルオキシソーム輸送における役割を明らかにする。ペルオキシソーム欠損症患者由来の変異を有する不安定型ペルオキシソーム局在性TAは、Pex19pとの結合が著しく低下しており、結果としてsemi-intact cellを用いたin vitro輸送系におけるペルオキシソームへの局在化が大きく低下することを見出している。品質不良型TAを認識して輸送を阻害、あるいは分解へと誘導する分子機構の存在を示唆する結果であり、免疫沈降法をはじめ種々の分子細胞生物学的手法を用いて解明する。
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