2014 Fiscal Year Annual Research Report
ヒトiPS細胞と霊長類モデルを用いた治療開発の基盤整備
| Project Area | Prevention of brain protein aging and dementia |
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| Project/Area Number |
26117007
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
岡野 栄之 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (60160694)
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| Project Period (FY) |
2014-07-10 – 2019-03-31
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| Keywords | iPS細胞 / マーモセット / 認知症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では患者iPS細胞由来神経細胞を用いた in vitro モデル系の構築、及びトランスジェニック霊長類作出技術を用いた in vivo 疾患モデル系を構築する。更に、これらの独立したモデル系を相互に連携させることで、脳タンパク質老化の分子機構から認知症発症に至る全体像を明らかにし、治療開発に繋げる。
まず、ヒト体細胞からのiPS細胞誘導法の改良を進めた。健常人由来抹消血単核球(PBMC)、及び単離したT細胞に、それぞれエピソーマルベクター法により再プログラム化因子を加え、フィーダー細胞上に播種した。フィーダー細胞にはマウス胎児線維芽細胞（MEF）あるいはSTO細胞を用いた。その結果、単離T細胞を用いてMEF上で樹立した際にiPS細胞誘導効率が最も高かった。
患者iPS細胞については、新潟大学脳研究所・池内健博士らと共同で患者体細胞の採取を進めている。既に、慶應義塾大学及び新潟大学の倫理審査委員会において本研究の倫理申請を行い、承認を得た。そこで、R406W変異を有するFTDP-17患者及びその家族の同意の元、採血を行った。患者２名の血液を用い、iPS細胞樹立を開始した。先行する１ラインについては、既に複数のiPSクローンを得た。
トランスジェニックマーモセットについては、P301L変異型タウ遺伝子をドキシサイクリン（Dox）誘導性に発現するレンチウイルスベクターと、Dox依存的転写活性因子(tTA)を神経細胞特異的に発現するレンチウイルスベクターの二種類のウイルスベクターをマーモセット初期胚に感染させることで、作出を進めている。ウイルスベクターを顕微注入した胚の一部において、ウイルスベクターが導入されたことを示す蛍光レポーター遺伝子の発現が認められたものの、いずれも発生を停止したため子宮移植には至っていない。引き続きウイルスベクターの顕微注入を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
倫理申請の承認及びR406W変異を有するFTDP-17患者２名からの採血を完了し、末梢血単核球及びT細胞の増幅を行った。これらのT細胞にリプログラミング因子を発現するエピソーマルベクターの導入を行い、iPS細胞の樹立を試みるに至った。先行して得られた患者１名の血液に関しては、既に複数のiPSクローンを得ることに成功した。これらの細胞の増幅及びPCRによりベクターが除去されていることの確認を現在行っており、研究は概ね順調に推移していると言える。
トランスジェニックマーモセットの作出については、P301L変異型タウ遺伝子をDOX誘導性に発現するコンストラクトと、tTAを神経系において発現するコンストラクトを作製し、それぞれレンチウイルスベクターを調製した。これらのレンチウイルスベクターを、マーモセット初期胚へ感染させる実験を開始するに至っている。現在、感染の指標とする蛍光レポーター遺伝子の発現がみられないか、あるいは蛍光レポーター遺伝子の発現がみられても途中で胚発生が停止しており、子宮移植には至らなかった。引き続きマーモセット初期胚へのウイルスベクターの感染実験を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
タウ遺伝子R406W変異を有する疾患iPS細胞については、先行して樹立した１ラインについて、エピソマールベクターの除去を確認し、iPS細胞としての性質を確認する。具体的には、多能性マーカーの発現、多分化能の確認、および核型解析を行う。残りの１ラインについては、引き続きiPS細胞の樹立を試みる。iPSクローンが得られ次第、同様の解析を行う。また、表現型解析のコントロールとして、ゲノム編集技術CRIPR/Cas9 系を用い、変異を正常型（R406）に修復したiPS細胞の作出を行う。並行して、神経分化誘導法について条件の最適化を試みる。材料が揃い次第、iPS細胞由来神経細胞における表現型解析を開始する。
トランスジェニックマーモセットの作出については、引き続きウイルスベクターの顕微注入を行い、良好な胚が得られ次第、仮親の子宮に移植を行う。また、現在用いているウイルスベクターによって良好なトランスジェニック胚が得られない場合に備え、発現調節の様式を変更し、薬剤によらず変異タウ遺伝子を恒常的に発現する改良型のレンチウイルスベクターの構築も並行して行う。
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[Journal Article] Clinical utility of neuronal cells directly converted from fibroblasts of patients for neuropsychiatric disorders: studies of lysosomal storage diseases and channelopathy.2015
Author(s)
Kano SI, Yuan M, Cardarelli RA, Maegawa G, Horiuchi Y, Higurashi N, Gaval-Cruz M, Wilson AM, Tristan C, Kondo MA, Chen Y, Koga M, Obie C, Ishizuka K, Seshadri S, Srivastava R, Kato TA, Sedlak TW, Lee Y, Rapoport JL, Hirose S, Okano H, Valle D, O’Donnell P, Sawa A, Kai M.
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Journal Title
Curr Mol Med.
Volume: 15
Pages: 138-45.
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Long-Term Safety Issues of iPSC-Based Cell Therapy in a Spinal Cord Injury Model: Oncogenic Transformation with Epithelial-Mesenchymal Transition.2015
Author(s)
Nori S, Okada Y, Nishimura S, Sasaki T, Itakura G, Kobayashi Y, Renault-Mihara F, Shimizu A, Koya I, Yoshida R, Kudoh J, Koike M, Uchiyama Y, Ikeda E, Toyama Y, Nakamura M, Okano H.
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Journal Title
Stem Cell Reports.
Volume: 4
Pages: 360-73
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Parkinson Disease: Diffusion MR Imaging to Detect Nigrostriatal Pathway Loss in a Marmoset Model Treated with 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine.2015
Author(s)
Hikishima K, Ando K, Yano R, Kawai K, Komaki Y, Inoue T, Itoh T, Yamada M, Momoshima S, Okano HJ, Okano H.
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Journal Title
Radiology.
Volume: 275
Pages: 430-7
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Focal Transplantation of Human iPSC-Derived Glial-Rich Neural Progenitors Improves Lifespan of ALS Mice.2014
Author(s)
Kondo T, Funayama M, Tsukita K, Hotta A, Yasuda A, Nori S, Kaneko S, Nakamura M, Takahashi R, Okano H,
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Journal Title
Stem Cell Reports.
Volume: 3
Pages: 242-9.
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Involvement of ER Stress in Dysmyelination of Pelizaeus-Merzbacher Disease with PLP1 Missense Mutations Shown by iPSC-Derived Oligodendrocytes.2014
Author(s)
Numasawa-Kuroiwa Y, Okada Y, Shibata S, Kishi N, Akamatsu W, Shoji M, Nakanishi A, Oyama M, Osaka H, Inoue K, Takahashi K, Yamanaka S, Kosaki K, Takahashi T, Okano H.
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Journal Title
Stem Cell Reports.
Volume: 2
Pages: 648-61
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] The use of induced pluripotent stem cells to reveal pathogenic gene mutations and explore treatments for retinitis pigmentosa.2014
Author(s)
Yoshida T, Ozawa Y, Suzuki K, Yuki K, Ohyama M, Akamatsu W, Matsuzaki Y, Shimmura S, Mitani K, Tsubota K, Okano H.
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Journal Title
Mol Brain.
Volume: 7
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Small RNA profiling and characterization of piRNA clusters in the adult testes of the common marmoset, a model primate.2014
Author(s)
Hirano T, Iwasaki YW, Lin ZY, Imamura M, Seki NM, Sasaki E, Saito K, Okano H, Siomi MC, Siomi H.
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Journal Title
RNA.
Volume: 20
Pages: 1223-37
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Utility of Scalp Hair Follicles as a Novel Source of Biomarker Genes for Psychiatric Illnesses.2014
Author(s)
Maekawa M, Yamada K, Toyoshima M, Ohnishi T, Iwayama Y, Shimamoto C, Toyota T, Nozaki Y, Balan S, Matsuzaki H, Iwata Y, Suzuki K, Miyashita M, Kikuchi M, Kato M, Okada Y, Akamatsu W, Mori N, Owada Y, Itokawa M, Okano H, Yoshikawa T.
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Journal Title
Biol Psychiatry.
Volume: 78
Pages: 116-25.
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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