2015 Fiscal Year Annual Research Report
タンパク質分子の動きを観るために結晶中に創り出した隙間を利用する新発想結晶解析
| Project Area | Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work |
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| Project/Area Number |
26119002
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
神田 大輔 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (80186618)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
稲垣 冬彦 北海道大学, 先端生命科学研究科(研究院), 特任教授 (70011757)
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| Project Period (FY) |
2014-07-10 – 2019-03-31
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| Keywords | タンパク質 / 動的構造 / Ｘ線結晶解析 / 結晶コンタクト / 融合タンパク質 / Tom20 / シグナル配列 / オリゴ糖転移酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ミトコンドリアプレ配列受容体であるTom20タンパク質に結合した状態のプレ配列ペプチドの大きな運動性を定量的に解析するために，マルトース結合タンパク質（MBP）との融合タンパク質をデザインした．隙間に位置したプレ配列ペプチドの運動の空間分布を視覚化するために，プレ配列のモデルを置かずに作成した差フーリエ電子密度マップを用いる．本年度はバルクソルベント補正の影響を検討した．バルクソルベントとはタンパク質結晶において，タンパク質分子間の空間を埋めているディスオーダーした水分子やイオンを指し，低分解能側のＸ線回折の強度を減少させる．このバルクソルベントによる減衰効果を補正する計算手法がバルクソルベント補正であり，通常のＸ線解析計算でも考慮されているが，本法では差電子密度マップの作成の際にローパスフィルターを使って低分解能側の回折データだけを抜き出して使うために，その影響を詳細に評価することが重要である．３つのＸ線解析計算用プログラム, REFMAC5, PHENIX, CNSを比較したところ，ほぼ同等の品質の電子密度が得られた．さらに詳しくみると，PHENIXの場合に一番体積の大きい電子密度が得られており，最新のバルクソルベント補正アルゴリズムを用いていることが理由であると推察された．
本法の適用を広げた．オリゴ糖転移酵素はＮ型糖鎖付加配列のアスパラギン残基にオリゴ糖鎖を転移する活性を持つ．この時，酵素は糖鎖付加配列中の3番目のセリン・スレオニン残基の側鎖を認識するポケットを用いて，糖鎖付加配列を認識することがわかっている．このポケットを構成するアミノ酸残基を含む20残基程度のセグメントが大きな運動性を持っていることがわかっているので，MBPとの融合タンパク質をつくって結晶解析を行った．その結果，このセグメントの大きな振幅の運動を可視化することができた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
結果的に原書論文（Protein Science, 2015）としてアクセプトされたが，採択に至るまでに，複数のレビューワーからのコメントに答えるための実験や原稿改訂に長時間を要した．上述のバルクソルベント補正の問題はその際に提起されたものである．今回の論文は，従来のタンパク質のＸ線結晶学のコンセプトには無いまったく新しい発想に基づいているため，レビューワーからのコメントも相当厳しいものがあったが，それらをクリアしたことで，多くのＸ線結晶科学者の疑問に答える水準になったと考えている．
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| Strategy for Future Research Activity |
論文審査過程のレビューワーからのコメントに答えるなかで，Ｘ線損傷を避けるために結晶をクライオプロテクタントの存在下に急速凍結させる操作中に，観測対象の運動分布に偏りが生じる可能性があり，しかもその偏りの仕方が結晶毎に異なる可能性があることがわかってきた．そこで，シンクロトロン施設における室温での回折測定の予備実験を行い，Ｘ線損傷の問題を回避できそうな感触が得られた．得られた電子密度の分布をクライオ凍結結晶と室温結晶で比較することで興味深い結果が得られると期待している．
結晶コンタクトフリー空間の応用の１つとして，結晶コンタクトによる「柔動構造の変形問題」の解決が考えられる．酵母のTim21タンパク質の結晶構造とＮＭＲ溶液構造では一部の構造が異なっている．そこで，この部分を結晶コンタクトフリー空間に置くことで，結晶内で溶液構造が再現されるかどうかを確かめる．そのための融合タンパク質のデザインとタンパク質発現を行う．
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