2016 Fiscal Year Annual Research Report
Rational design of crystal contact-free space in protein crystals for analyzing spatial distribution of motions within protein molecules
| Project Area | Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work |
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| Project/Area Number |
26119002
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
神田 大輔 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (80186618)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
稲垣 冬彦 公益財団法人微生物化学研究会, 微生物化学研究所, 客員研究員 (70011757) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2014-07-10 – 2019-03-31
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| Keywords | タンパク質 / 動的構造 / Ｘ線結晶解析 / 結晶コンタクト / 融合タンパク質 / Tom20 / シグナル配列 / Tim21 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
結晶コンタクト効果フリーな“隙間”を結晶格子中につくり，「結晶コンタクトによる柔動構造の変形・固定問題」の解決を目指している．ミトコンドリアプレ配列受容体Tom20タンパク質とマルトース結合タンパク質（MBP）の融合タンパク質を作製し，MBPとTom20の間にできる空間を利用して，Tom20に結合した状態のプレ配列ペプチドの動きを電子密度として可視化する．Tom20によるプレ配列の認識は，特異性が広くpromiscuous 認識の典型である．Promiscuous 認識の分子構造基盤は結合状態における大きな運動性に起因すると考えている．現在得られている電子密度マップではプレ配列ペプチドの大きな振幅の動きの重なり部分に対応しており，運動全体の空間分布を見積もるには電子密度マップのシグナル・ノイズ比を改善する必要がある．そこで，複数の結晶のマップを積算して電子密度マップの改善を行う．結晶化条件の改良により安定して結晶を得ることができるようになったが，興味深いことに構造多形が見られた．すなわち，MBPとTom20の間を繋ぐ長いαヘリックスリンカーの曲がり具合が複数存在し，その結果，結晶コンタクトフリー空間の大きさが変わって，その中のプレ配列の電子密度にも違いが見られた．
結晶コンタクトフリー空間の利用法として，結晶コンタクトによるタンパク質構造の変形を除くことができる．結晶構造と溶液NMR構造の両方が決定されていて，一部の構造が異なる例として酵母のTim21タンパク質を選択した．MBPとの融合タンパク質を作成し，結晶化と構造決定を行った．その結果，結晶コンタクトフリー空間に置いた当該セグメントは結晶構造ともNMR構造とも異なったコンホメーションをとっていた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実績でも述べたとおり，複数のMBP-Tom20/プレ配列ペプチドの結晶を得てＸ線解析を行ったが，MBPとTom20の間にあるαヘリカルリンカーの曲がり具合に多形性が見られた．構造多形の原因は凍結操作にあると推定される．凍結操作によるこうした結晶全体のコヒーレントな変形はアミノ酸側鎖レベルでは知られているが，主鎖レベルでは珍しい．原因として大きな容積の結晶コンタクトフリー空間を結晶内に作ったことが考えられる．今後，結晶コンタクトフリー空間の利用の一般化を目指す上で，この凍結変形と構造多形の原因を探求し，制御の方法を見つけることが重要な課題である．
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| Strategy for Future Research Activity |
MBP-Tom20/プレ配列ペプチドの結晶の電子密度マップを改善する以外に，プレ配列に原子番号の大きい原子を導入して，その位置分布を調べることが考えられる．4-iodo-phenylalanineをペプチド合成によりプレ配列に導入する実験を行う．凍結操作による変形の問題を検討するために，シンクロトロン施設における室温での回折測定の実験を継続して検討する．一方，凍結した多数の結晶のリンカーヘリックスの曲がり具合の統計をとることで，曲がり具合が連続的に分布するのか，２つの状態（まっすぐと曲がる）に分かれるのかを検討する．
MBP-Tim21の結晶内のセグメントの構造は，結晶構造ともNMR構造とも異なっていた．解釈にあたってNMR構造ではNOEの数が少ない部分の構造は，必ずしも溶液中の正しい構造（あるいは構造分布）ではないことに留意すべきである．一方，今回の融合タンパク質結晶中に形成された結晶コンタクトフリー空間は結晶コンタクトの影響を除く目的には不十分なために，真の溶液構造とは異なった構造が得られた可能性もある．そこで，実験結果の解釈を進めるために，リンカーの長さが異なる第2，第3の融合タンパク質の作成と結晶構造解析を進める．
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