2017 Fiscal Year Annual Research Report
Rational design of crystal contact-free space in protein crystals for analyzing spatial distribution of motions within protein molecules
| Project Area | Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work |
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| Project/Area Number |
26119002
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
神田 大輔 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (80186618)
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| Project Period (FY) |
2014-07-10 – 2019-03-31
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| Keywords | タンパク質 / 動的構造 / Ｘ線結晶解析 / 結晶コンタクト / 融合タンパク質 / Tom20 / シグナル配列 / Tim21 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
結晶コンタクト効果フリーな隙間を結晶格子中につくり，結晶コンタクトによる柔動構造の変形・固定問題の解決を目指している．Tom20タンパク質とマルトース結合タンパク質（MBP）の融合タンパク質を作製し，MBPとTom20の間にできる空間を利用して，Tom20に結合した状態のプレ配列ペプチドの動きを電子密度として可視化する．本年度はMBP-Tom20/プレ配列複合体の10個以上の結晶についてX線回折測定と解析を行った．興味深いことに差電子密度マップ中の結晶コンタクトフリー空間の中に見られるプレ配列ペプチドの電子密度に多形が見られた．電子密度が比較的よく見える結晶と，そうではない結晶がほぼ半々の割合であった．新しい方法として原子番号の大きい原子を導入して位置分布を解析する実験の検討を進めた．4-ヨードフェニルアラニンをプレ配列に導入した3種のペプチドのデザインについて結晶が得られた．微結晶に適したビームラインの測定である程度の分解能のデータが得られることがわかった．
結晶コンタクトフリー空間の利用の一つとして結晶コンタクトによるタンパク質構造の変形を除くことがある．結晶構造と溶液NMR構造が決定されていて一部のセグメントのコンホメーションが異なる例として酵母のTim21タンパク質を選択した．MBPとの融合タンパク質を作成して結晶化と構造決定を行った．リンカーの長さが異なる3つの結晶構造が得られたが，結晶コンタクトフリー空間に置いた当該セグメントのコンホメーションは互いに異なり，しかも従来の結晶構造ともNMR構造とも異なるコンホメーションであった．互いにコンホメーションが異なっていることは結晶コンタクトフリー空間が完全に溶液条件と同じでないことを示唆している可能性がある．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
複数のMBP-Tom20/プレ配列ペプチドの結晶を得てＸ線結晶解析を行うと，結晶コンタクトフリー空間に置いたプレ配列ペプチドの電子密度に多形が見られる．結晶化条件，結晶単位格子の大きさ，構造精密化計算のパラメータの違いなどで説明ができるかどうかを詳細に検討したが，相関するような因子は見つからなかった．そこで，電子密度の多形の原因は凍結操作にあると推定している．結晶の凍結操作では結晶をループで拾った後に，液体窒素に投入して急速凍結させる．その際，液体窒素の上面にある冷却された窒素ガスを通過する．ガス層を通過する時間の間に凍結が始まってしまうことが原因となる可能性がある．通常の結晶凍結操作では問題になることはほとんどないが，大きな容積の結晶コンタクトフリー空間を結晶内に作ったことが理由であると推定される．MBP-Tim21の注目セグメントのコンホメーション多形においても，この凍結の問題が絡んでいる可能性がある．今後，結晶コンタクトフリー空間の利用の一般化を目指す上で，この凍結変形と構造多形の原因を追求し，制御の方法を見つけることが重要な課題である．
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| Strategy for Future Research Activity |
凍結操作による多形・変形の問題を検討するために，窒素ガス層の厚さを調節して凍結操作を行い，電子密度を比較する実験を進める．また，室温での回折測定を行う．SPring8 BL44XUにおいて行った室温回折測定の予備実験では，幸いなことにTom20とTim21ともにX線による損傷を受けにくい結晶であることが判明した．室温回折測定でもクライオ条件の回折測定の結果と比較可能なデータが得られることを期待できる．アテニュエーターを入れてX線強度を落とすことと，多数の結晶からのデータをマージする必要があると予想している．
MBP-Tim21の結晶内の注目セグメントのコンホメーションは結晶構造ともNMR構造とも異なっている．解釈にあたってNMR構造ではNOEの数が少ない部分の構造は，必ずしも溶液中の正しい構造（あるいは構造分布）と一致していないことに留意すべきである．一方，今回の融合タンパク質結晶中に形成された結晶コンタクトフリー空間は結晶コンタクトの影響を除く目的には完全とは言えないために，真の溶液構造とは異なったコンホメーションが得られた可能性もある．実験結果の解釈を進めるために，分子動力学計算を溶液中の条件と結晶中の条件でそれぞれ進める．
溶液中の動きを評価するための手法としてX線小角散乱(SAXS)を使った手法の開発を新たに検討する．重原子を２つ導入し，重原子間の距離の分布関数を決定する．多数の軽原子の影響を除くために，重原子が1個あるいは0個のSAXSも測定し，４つのSAXSデータの差し引きをする方法，低分子量化合物を添加してコントラストマッチングを行う方法，重原子の異常散乱を使って２つの異なるX線波長で測定して差をとる方法などを試す．モデル実験用の試料として，フレキシブルなPEG（ポリエチレングリコール）骨格でつながった２つのヨウ素原子を含む化合物の調製を完了している．
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