2018 Fiscal Year Annual Research Report
Rational design of crystal contact-free space in protein crystals for analyzing spatial distribution of motions within protein molecules
| Project Area | Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work |
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| Project/Area Number |
26119002
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
神田 大輔 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (80186618)
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| Project Period (FY) |
2014-07-10 – 2019-03-31
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| Keywords | タンパク質 / 動的構造 / Ｘ線結晶解析 / 結晶コンタクト / 融合タンパク質 / Tom20 / Tim21 / X線小角散乱 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
結晶コンタクト効果フリーな空間（CCFS）を結晶格子中につくり，結晶コンタクトによる柔構造の変形・固定問題の解決を行う．２つの技術要素は，タグタンパク質との融合タンパク質の作製と２つのタンパク質を一本の長いヘリックスを用いて硬く接続することである．ミトコンドリアタンパク質Tom20によるプレ配列認識は「複数の部分的認識状態の動的平衡」で達成される（Biophys Rev, 2018）ことを検証するために，プレ配列中のコンセンサス配列にアミノ酸置換や4-ヨードフェニルアラニンを導入などを行い，MBP-Tom20-プレ配列の融合タンパク質の結晶化を行った．シーディングにより回折測定に適した大きさの結晶を得た．CCFSの他の利用法として結晶コンタクトによる柔構造の変形を除くことができる．酵母ミトコンドリアTim21タンパク質を選択し，MBPとの融合タンパク質の結晶構造決定を行った．その結果，CCFS中のループの構造は通常の結晶構造とNMR溶液構造のどちらとも異なっていた．そこで，NMR構造を再決定し，MD計算による溶液構造の推定を行った結果，CCFS中のループの構造は真の溶液構造の代表構造と見なして良いと結論した．
溶液中の動きを評価するためにX線小角散乱(SAXS)を使った方法を検討した．２つの重原子間の距離分布関数を決定する．軽原子の影響を除くために，重原子が1個あるいは0個のSAXSも測定し，４つのSAXSデータの加減算を行う．フレキシブルなポリエチレングリコール骨格でつながった２つのヨウ素原子を含む化合物を合成・測定して，PEG骨格がランダムなコンホメーションをとると仮定したときの距離分布関数に一致する結果を得ることに成功した．その他，ランチオニンペプチドの２つの溶液状態の構造決定と動的交換をNMRを用いて詳細に調べた(Commun Biol, 2018).
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| Research Progress Status |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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