2015 Fiscal Year Annual Research Report
ODMRとin-cell NMRによる細胞内蛋白質間相互作用・動態の解析法の開発
| Project Area | Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work |
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| Project/Area Number |
26119004
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
白川 昌宏 京都大学, 工学研究科, 教授 (00202119)
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| Project Period (FY) |
2014-07-10 – 2019-03-31
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| Keywords | ODMR / in-cell NMR / 細胞内蛋白質 / 細胞小器官 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ODMR（光検出磁気共鳴）を利用した細胞・生体内の分子の構造や運動の超分解能イメージング・計測とin-cell NMR法の開発により細胞内における動的構造生物学の手法の確立を、通常のin vitroにおける構造・運動性解析と共に遂行した。
ODMRを利用したイメージングにおいて必要となる要素技術は、①測定/技術、②プローブ粒子の至適化と蛋白質の標識化、③細胞へのターゲッティング、④得られた情報の処理と解釈である。
①については、本年度までにプローブ粒子の角度変化(回転運動)を精密に解析する手法を確立した。②のプローブの至適化には目覚ましい進歩が見られた。数十nm径オーダーの微粒子を超分岐鎖グリセロールで表面加工することで、ODMR活性を持つ粒子を親水性化し、水溶液中で粒子間の非特異的吸着による凝集体形成を回避させ、高密度の分散状態に保つ事に成功した。また蛋白質・脂質等への非特異的吸着を激減させることが出来た。③についてもプローブ粒子を抗体やアビジンと架橋することで膜蛋白質やモーター蛋白質へのターゲティングに成功した。④については、F1-ATPaseの回転運動を計測・解析することに成功した。
in-cell NMRに関しては、細胞培養の培地を循環させることで長時間計測を可能にする手法（Ogino et al., JACS 2009）の導入を試み一定の成果を得た。これにより、in-cell3-dimensional NMRの測定や、緩和時間の測定への道が開かれる。またリジンの側鎖を13C-ジメチル修飾した蛋白質がin vitroで高感度測定しうることを示した。またin-cell NMRでdeuiquitination enzyme (DUB)に対して、耐性なdiubiqitinを細胞に導入したところ、即座に凝集体となった。この現象は生物学的意味を持つと考え、研究を始める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ODMRの開発研究で必要な要素技術は、①測定技術、②プローブの至適化と蛋白質の標識、③細胞への導入、④得られた情報の処理と解釈、である。①と②のプローブの至適化、④の情報処理等については、基本的な項目については前年度までに行っており、今年度には、さらにこれらの技術を高度化すると共に②の蛋白質の標識と③に集中的に取りかかる事を予定していた。細胞生物学的に重要な細胞膜・細胞骨格にナノダイアモンドのターゲッティングを目指した。ナノダイアモンドの振動状態を計測し、細胞内の運動性分布を得るためである。特に細胞骨格と細胞膜の運動は、メカノトランスダクションの点からも興味深い。細胞膜へのターゲッティングは、膜受容体蛋白質であるEGF受容体に対する抗体とIL-18受容体のリガンドであるIL-18をナノダイアモンド粒子に共有結合で付加することで行った。A431細胞表面のEGF受容体を標識した粒子の回転運動性をODMRで3次元計測し、解析することに成功した。角度変化ヒストグラムから見た膜振動は、無処理でも等方的で一定量存在するが、EGF添加により細胞骨格の密度を上げると運動性は制限され、見かけの拡散係数、粘度共に減少した。一方、ラトラクリンAを加えて、アクチンを脱重合すると、運動性が大幅に増加し、拡散係数、粘度共に大きく増加した。こうして、細胞骨格と膜ダイナミクスの関連が、その異方位を含めて定昇的に測定できた。つまり粒子は等方的な運動をしており、その強度は細胞膜直下のアクチン繊維の密度に強い負の相関を示すことが判った。生体分子の運動に関しては、HPG-ビオチン化したナノダイアモンド粒子を、ストレプトアビジンンを介してF1-ATPasaのγサブユニットに固定し、各時間でNDのスペクトルを測定し、その向きを3次元で決定した。回転といった規則正しい運動のみで無くランダムな運動も検出できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
ODMRに関する研究では、要素技術となる①測定技術、②プローブ粒子の至適化とタンパク質の標識化、③細胞へのターゲッティング、④得られた情報の処理と解釈、について完成を目指す。①に関しては装置の改良、取り分け光学系検出器の感度向上と検出手法の至適化により時間単位の感度向上を目指し、まだin vitroの系でしかODMR信号の検出を行っていない5 nm径ダイアモンドナノ粒子について、細胞における高時間分解能イメージングを達成する。③については、細胞内オルガネラや細胞骨格へのターゲッティングを行う。具体的にはミトコンドリア膜やアクチン線維である。これらの運動性や立体構造変化を計測できると生理学的に極めて興味深い情報が得られる。また磁気共鳴系においてはマイクロ波のパルス照射が可能になるようにハードウエアを改良し、感度上昇を目指すと共にELDORなどの多重共鳴パルスESR測定によるスピン間距離の計測へと進む。さらに、測定手法の導入、改良に伴い、④のデータ処理技術も、適時改訂・開発を行う。加えてパルス化を行うと緩和時間測定が出来るので、その実験手法の導入とデータ処理手法の開発も進める。感度と精度の高い手法の確立を目指し、将来的にそのセンサーを、膜イオンチャネルや、好中球、ミトコンドリア、葉緑体の膜にターゲットできると、緩和時間の変動を計測するとともに、モデルを立て、活性化機構を解析できる。
In-cell NMRに関しては、蛋白質の細胞内の回転拡散と水平拡散を計測し、in vitroの実験結果も加えて細胞内蛋白質の受けるMacromolecular crowding効果等を精査し、蛋白質の立体構造や機能に与える影響を流体力学的観点からも解析する。そのためRheo-NMRの手法も拡充する予定である。
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[Journal Article] Nucleosome compaction facilitates HP1γ binding to methylated H3K9.2015
Author(s)
Mishima Y, Jayasinghe CD, Lu K, Otani J, Shirakawa M, Kawakami T, Kimura H, Hojo H, Carlton P, Tajima S, Suetake I.
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Journal Title
Nucleic Acids Res.
Volume: -
Pages: gkv841
DOI
Peer Reviewed
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