2016 Fiscal Year Annual Research Report
ODMRとin-cell NMRによる細胞内蛋白質間相互作用・動態の解析法の開発
| Project Area | Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work |
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| Project/Area Number |
26119004
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
白川 昌宏 京都大学, 工学研究科, 教授 (00202119)
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| Project Period (FY) |
2014-07-10 – 2019-03-31
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| Keywords | ODMR / in-cell NMR / 細胞内蛋白質 / 細胞小器官 / Rheo-NMR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内蛋白質・小器官の立体構造・運動性・超分子複合体形成等と温度活性酸素濃度や微水流といった環境を生きた細胞の中で計測する手法の開発を目的とし、細胞内の特定の蛋白質の高次元NMR測定であるin-cell NMR法、蛋白質の構造と集合状態に対する影響を計測するRHEO(RHEOLOGY)-NMR、ダイアモンドナノ粒子(ND)を使った光検出磁気共鳴法（ODMR）の装置と測定手法を開発する。
ODMRに関しては、要素技術である①測定技術、②プローブ粒子の至適化とタンパク質の標識化、③細胞へのターゲッティング、④得られた情報の処理と解釈、について完成を目指す。①に関しては装置の改良、特に光学系検出器の感度向上と検出手法の至適化により時間単位の感度が向上した。まだin vitroの系でしかODMR信号を測定していなかった5 nm径ＮＤについて、細胞における高時間分解能イメージングを目指したが、超多分岐修飾が凝集体系性に阻まれおり、今後の課題である。③については、細胞内小器官や細胞骨格、具体的にはアクチン線維へターゲッティングした。線維状のアクチン分子の線維軸廻りの回転運動は、伸縮長と良い相関を示すこと、回転運動性は同一線維や束状では同調すること等が判明し、ＮＤを用いたODMRにより細胞内の蛋白質集合体の微細な動きをリアルタイム検出できることが証明された。
In-cell NMRに関しては、蛋白質の細胞内の並進拡散を計測しうるin-cell diffusion NMRの準備的な測定を行い、今後は再現性を含めてより精度と信頼度の高い測定法の確立を目指すと共に、FRAP等の蛍光を使った測定と比較対照しながら解析を進める。蛋白質の立体構造や機能に与える影響を流体力学的観点からも解析するためRheo-NMRを導入し、大変興味深い結果を得た。解釈を含め検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では細胞内蛋白質・小器官の立体構造・運動性・超分子複合体形成等を生きた細胞の中で計測する手法の確立を目的とし、細胞内の特定の蛋白質の高次元NMR測定であるin-cell NMR法とダイアモンドナノ粒子(ND)を使った光検出磁気共鳴法（ODMR）の開発を進めた。
ODMRに関する研究では、要素技術となる①測定技術、②プローブ粒子の至適化とタンパク質の標識化、③細胞へのターゲッティング、④得られた情報の処理と解釈、について開発研究を行った。①に関しては装置の改良、取り分け光学系検出器の感度向上と検出手法の至適化により時間単位の感度向上をすすめた。③については、アクチン線維にナノダイアモンド粒子をターゲティングする事に成功した。特にアクチン線維へのターゲティングは、ODMRの測定により、アクチン粒子が、繊維長の伸縮に伴い線維軸を軸とする回転をすること、その運動が同一線板場状では同期していることを示した。これは当初に掲げた大きな目標の一つで、本研究のランドマーク的成果である。また磁気共鳴系においてはマイクロ波のパルス照射が可能になるようにハードウエアの改良と、其れを利用した緩和時間測定の実験手法の導入とデータ処理技術の開発を進めた。ELDORなどの多重共鳴パルスESR測定によるスピン間距離の計測への準備は共同研究者のETHの瀬川博士によって進められた。と進む。さらに、測定手法の導入、改良に伴い、④のデータ処理技術も適時、改訂・開発を行う。
In-cell NMRに関しては、蛋白質の細胞内の並進拡散の準備的な計測を試みた。流体力学的効果が蛋白質の立体構造や機能に与える影響を解析するためRheo-NMRの装置を開発し、測定を行った。非常に興味深い結果を得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞内蛋白質・小器官の立体構造・運動性・超分子複合体形成等を生細胞中で計測する手法の開発を目的とし、細胞内の特定の蛋白質の高次元NMR測定であるin-cell NMR法とダイアモンドナノ粒子(ND)を使った光検出磁気共鳴法（ODMR）の開発を更に進める。
その目的を達成するために、以下の方策で研究を進める。
ODMRを利用したナノジャイロメーターの開発研究に関しては、細胞膜、核、ミトコンドリアなどのオルガネラ、細胞骨格繊維等にターゲッティングし、様々な生命現象における蛋白質の動態を解析しうる手法の確立を目指してきた。昨年度までに、in vitroのF1-ATPaseの回転、細胞内アクチンファイバーの捻れ振動、膜タンパク質の振動については満足できる手法を確立しえた。今後はこれらを基にして、種々の細胞内タンパク質、オルガネラの運動の定量的解析モデルを構築する。
粒子近傍のラジカル量等の計測を目指した、ダイアモンド中のNVＣ(-)に局在する電子の緩和時間測定については、昨年度からの研究を継続し、感度と精度の高い手法の確立を目指す。そのセンサーを、膜イオンチャネルや、ミトコンドリア、葉緑体の膜にターゲットし、緩和時間の変動を計測するとともに、モデルを立て、ラジカル量等やその発生機構などを解明する。
in-cell NMRに関しては、細胞内の並進拡散係数の測定をすると共に、細胞内の蛋白質の緩和実験から、回転拡散の相関時間等のデータを得る。得られた情報の処理と解釈により、その流体力学的効果を明らかにする。蛋白質の挙動はRheo-NMRによっても検証する。
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