2014 Fiscal Year Annual Research Report
生細胞内の生命反応をリアルタイムで捉えるin-cell NMR法の開発と応用
| Project Area | Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work |
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| Project/Area Number |
26119005
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
西田 紀貴 東京大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (50456183)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
甲斐荘 正恒 首都大学東京, 理工学研究科, 教授 (20137029)
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| Project Period (FY) |
2014-07-10 – 2019-03-31
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| Keywords | in-cell NMR / バイオリアクター / 酸化ストレス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内酸化還元タンパク質であるチオレドキシン(Trx)のin-cell NMRシグナルに基づいて、酸化ストレスに対する細胞内応答の検出を試みた。今年度はまずTrxの酸化還元状態を検出するためのプローブの探索を行った。まずLeu, Val, Ileの側鎖メチル基について検討したところ、活性中心の酸化還元に伴う化学シフト変化が小さく他のプローブを探索する必要があることが分かった。そこで、Alaの側鎖メチル基を調べたところ、活性中心近傍に存在するA29は酸化還元状態に応じて顕著な化学シフト変化を示したことからプローブとして適していると判断した。そこで、細胞内観測のためAla側鎖メチル基以外を重水素標識したTrxをHeLa S3細胞内に導入し、in-cell NMR測定を行った結果、30分程度の測定で細胞内のTrxのシグナルを感度よく検出できることが分かった。また、用いたHeLaS3細胞内ではTrxはほぼ還元状態に保持されていることも確認することができた。また、in-cell NMR測定の感度向上の試みとして、安定同位体標識タンパク質が細胞内での代謝によって分解しシグナル強度が減少するという問題の解決に取り組んだ。灌流する培地に様々なプロテアーゼ阻害剤を添加した条件でin-cell NMR測定を行った結果、プロテアソーム阻害剤MG132を添加した条件で顕著にシグナル強度の減少が抑制できることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画とはやや異なるがアラニン側鎖メチル基をプローブとして、細胞内Trxの酸化還元状態を感度よく観測する系を確立することができたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
予定通りに進んでおり研究計画に特段の変更はない。来年度以降、細胞に酸化ストレスを加えた条件下でのin-cell NMR解析に着手する。
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