2016 Fiscal Year Annual Research Report
生細胞内の生命反応をリアルタイムで捉えるin-cell NMR法の開発と応用
| Project Area | Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work |
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| Project/Area Number |
26119005
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
西田 紀貴 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 准教授 (50456183)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
甲斐荘 正恒 首都大学東京, 理工学研究科, 客員教授 (20137029)
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| Project Period (FY) |
2014-07-10 – 2019-03-31
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| Keywords | in-cell NMR / バイオリアクター / 酸化ストレス / シグナル伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞への酸化ストレスに対する細胞内チオレドキシン（Trx）の応答を観測するため、昨年度までに確立した細胞内Trxのin-cell NMR観測法をさらに改良し、細胞内酸化還元電位（Eh）を規定するグルタチオンの酸化還元状態を同時にin-cell NMR観測する手法の確立を行った。まずアラニン側鎖メチル基を選択的に1H,13C標識したTrxを導入したHeLaS3細胞を、13C標識システインを含む培地中で一晩培養することにより、細胞内のTrxとグルタチオンの両方が安定同位体標識された細胞を調製した。得られた細胞に対して培地を灌流しながらin-cell NMR観測を行った結果、Trx、グルタチオンともに約20分程度で十分な感度でNMRシグナルを観測することができた。酸化ストレス非存在下においては、グルタチオン、Trxともにほとんどが還元型として観測され、細胞内が還元的に保持されていることが示された。
さらに本年度は代表的な低分子量GTPaseであるRasを対象としたin-cell NMR研究に着手した。まず、細胞内におけるRasの活性状態（GTP結合型割合）を観測する適切なプローブの探索を行った。その結果、Ile21の側鎖メチル基がGTP結合型とGDP結合型で顕著な化学シフト変化を示したことから、これらのシグナル強度に基づいて細胞内における活性割合を評価する有用なプローブであると判断した。実際に、Rasを細胞に導入しIle21のシグナルを指標としたRasのin-cell NMR観測を行った結果、野生型Rasの細胞内における活性状態はほぼ完全に不活性型に保たれていることが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
同一細胞内のTrxとグルタチオンの両方の酸化還元状態をin-cell NMR法により観測する新たな手法を確立し、酸化ストレスに対する細胞内Trxの応答を検出するための準備が整ったため。また、細胞内のシグナル伝達蛋白質の一つであるRasについても、その活性状態を感度よく観測するプローブを見出すことができており、本研究は順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は細胞に対して様々な酸化ストレスを加えることにより、細胞内酸化還元電位（Eh）の変化に対する細胞内Trxの応答をリアルタイムで観測することを目指す。また、酸化ストレスを与えた細胞の性状（アポトーシスやネクローシスなど）をフローサイトメトリーにより解析し、NMR観測結果と比較する。さらに、様々な種類のがんを引き起こすことが知られているRasの活性型変異体（G12Vなど）を細胞内に導入して、実際の生理的環境下での活性割合を算出する。また、Rasの活性阻害する化合物の作用を細胞内で検出する。
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