2018 Fiscal Year Annual Research Report
Real-time observation of the biological events within living cells using in-cell NMR
| Project Area | Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work |
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| Project/Area Number |
26119005
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
西田 紀貴 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 准教授 (50456183)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
甲斐荘 正恒 首都大学東京, 理学研究科, 客員教授 (20137029)
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| Project Period (FY) |
2014-07-10 – 2019-03-31
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| Keywords | 核磁気共鳴法 / in-cell NMR / 低分子量GTPase / バイオリアクター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までに、細胞内におけるRasの活性状態（GTP結合型割合）のin-cell NMR観測を行った結果、野生型Rasおよび発癌性変異体（G12V、G13D、Q61L）の細胞内におけるGTP結合型割合はin vitroよりも低下しており、細胞内の加水分解速度定数（khy）の上昇と、GDP-GTP交換速度定数（kex）の低下の両方が寄与していることが明らかとなった。本年度は細胞内におけるRasのGTP結合型割合に変調を与える要因を解明するため、(I)内在性GTPase活性化蛋白質（GAP）、(II)細胞内分子混雑環境の2点に着目した解析を行った。
まず、内在性GAPの寄与を定量するため、代表的なGAPであるp120およびNF1をそれぞれノックアウトした細胞をゲノム編集法により作製し、in-cell NMRによりKO細胞中におけるRasのGTP結合型割合の変化を解析した。その結果、野生型RasのGTP型割合はいずれのKO細胞中においても有意な差は観測されなかったものの、T35S変異体ではNF1KO細胞中でコントロール細胞よりも顕著なGTP結合型割合の増大が観測された。したがって、細胞内Rasの加水分解亢進におけるNF1の寄与を選択的かつ定量的に評価できることが明らかになった。
また、様々な分子クラウダ―を添加して、細胞内分子混雑環境を模倣した条件下におけるkhyならびにkexの測定を行った。その結果、グリセロール存在下ではkexが野生型および全ての変異体で顕著に低下してたことから、粘性の増大によって細胞内Rasのkexの低下が引き起こされていることが示唆された。
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| Research Progress Status |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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[Journal Article] A Numb-Mdm2 fuzzy complex reveals an isoform-specific involvement of Numb in breast cancer chemoresistance and progression2018
Author(s)
Ivan Nicola Colaluca, Andrea Basile, Veronica D’Uva, Davide Disalvatore, Manuela Vecchi, Stefano Confalonieri, Marina Mapelli, Salvatore Peace, Pier Paolo Di Fiore, Chun-Jiun Yang, Masatsune Kainosho, Michael Sattler
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Journal Title
J. Cell Biol.
Volume: 217
Pages: 745-762
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Evolution and diversification of the plant gibberellin receptor GID12018
Author(s)
Hideki Yoshida, Eiichi Tanimoto, Takaaki Hirai, Yohei Miyanoiri, Rie Mitani, Mayuko Kawamura, Mitsuhiro Takeda, Sayaka Takehara, Ko Hirano, Masatsune Kainosho, Takashi Akagi, Makoto Matsuoka, and Miyako Ueguchi-Tanaka
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Journal Title
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Volume: 115
Pages: 7844-7853
DOI
Peer Reviewed
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