前胸腺刺激ホルモンを中心とした昆虫脳ペプチド類の構造、機能および動態

1990 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 01060004
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 鈴木 昭憲 東京大学, 農学部, 教授 (90011907)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岩見 雅史 名古屋大学, 理学部, 助手 (40193768) ; 石崎 宏矩 名古屋大学, 理学部, 教授 (60025343) ; 長澤 寛道 東京大学, 農学部, 助手 (60134508)
• Keywords: 前胸腺刺激ホルモン / カイコ / ボンビキシン / 羽化ホルモン / ペプチド合成 / ジスルフィド結合 / 遺伝子解析 / 遺伝子発現

Research Abstract

本年度の成果は以下のとおりである。
(1)カイコの前胸腺刺激ホルモン(PTTH)のcDNAを組み込んだ発現ベクタ-(pETPTTH)を作製し、これを大腸菌に導入してPTTHを大量発現させた。菌体から抽出、精製した結果、活性を有する二量体分子を約1mg/lの収量で得ることができた。これを用いてジスルフィド架橋様式を調べたところ、N末端から15残基目のCys同士の1対でのみ単量体間のジスルフィド架橋がかかっており、残りのCysは単量体内で3対のジスルフィド結合を形成していると推定された。遺伝子解析の結果、PTTH遺伝子はゲノムあたり1コピ-であることがわかった。また、抗PTTH抗体を用いた脳とアラタ体の免疫組織化学を経時的に追跡したが、顕著な変化は認められなかった。
(2)分子内に存在する3対のジスルフィド結合を位置選択的に架橋する方法を開発し、この方法を利用してボンビキシンーIIとーIVの全合成に成功した。また、この方法を用いてエリカイコから遺伝子が単離されているボンビキシン様ペプチドを合成したが、そのペプチドの活性はボンビキシンーIIの1/100〜1/1000と弱かった。ボンビキシンmRNAのin situハイブリダイゼイションをジゴキシゲニン標識法により全脳で行う方法を開発した。この方法で、エリカイコ脳中央部9対の細胞で発現していることを確認した。PCR法を用いてこれまでに見つかっていなかったボンビキシンーIVの遺伝子を明らかにすることができた。
(3)カイコ羽化ホルモンの分子多様性をアミノ酸配列のレベルで明らかにし、この分子を大腸菌を用いて発現させた。カイコ性フェロモン生合成性化神経ペプチドのC末端部の類縁体を多数合成し、C末端5残基が活性を示す最小のペプチドであることを明らかにした。カイコの脂質動員ホルモンを単離、構造決定したところ、これまでに鱗翅目昆虫から単離されている脂質動員ホルモンと同一のアミノ酸配列をもつことがわかった。

Research Products

• [Publications] Atsushi Kawakami,et al.: "Molecular cloning of the Bombyx mori prothoracicotropic hormone" Science. 247. 1333-1335 (1990)
• [Publications] Akira Mizoguchi: "Immunohistochemical localization of prothoracicotropic hormoneーproducing neurosecretory cells in the brain of Bombyx mori" Develop.Growth & Differ.32. 591-598 (1990)
• [Publications] Hiroshi Kataoka: "Prothoracicotropic hormone of the silkworm,Bombyx mori:amino acid sequence and dimeric structure" Agric.Biol.Chem.55. 73-86 (1991)
• [Publications] Masafumi Iwami: "A novel family C of the genes that encode bombyxin,an insulinーrelated brain secretory peptide of the silkmoth Bombyx mori:isolation and characterization of gene Cー1" Insect Biochem.20. 295-303 (1990)
• [Publications] Kazunori Maruyama: "Structure and synthesis of bombyxinーIV,a brain peptide of the silkworm Bombyx mori" Peptide Chemistry 1989. 251-256 (1990)
• [Publications] D.Zitnan: "Developmental changes in the bombyxinーand insulinーlike immunoーreactive neurosecretory system in the wax moth,Galleria mellonella" Develop.Growth & Differ.32. 637-645 (1990)
• [Publications] Akira Mizoguchi: "Developmental change of bombyxin content in the brain of the silkmoth,Bombyx mori" J.Insect Physiol.36. 655-664 (1990)
• [Publications] Takaharu Kono: "Eclosion hormone of the silkworm Bombyx mori.Expression in Escherichia coli and location of disulfide bonds" FEBS Lett.263. 358-360 (1990)
• [Publications] Takaharu Kono: "Isolation and complete amino acid sequences of eclosion hormones of the silkworm,Bombyx mori" Insect Biochem.(1991)
• [Publications] Akihiro Kitamura: "Isolation and amino acid sequence of pheromoneーbiosynthesisーactivating neuropeptide (PBAN) of the silkworm,Bombyx mori" Peptide Chemistry 1989. 63-68 (1990)
• [Publications] Shogo Matsumoto: "Functional diversity of a neurohormone produced by the suboesoーphageal ganglion:molecular identity of melanization and reddish colouration hormone and pheromone biosynthesis activating neuroーpeptide" J.Insect Physiol.36. 427-432 (1990)
• [Publications] Akihiro Kitamura: "Amino acid sequence of pheromone biosynthesis avtivating neuropeptideーII (PBANーII) of the silkmoth,Bombyx mori" Agric.Biol.Chem.54. 2495-2497 (1990)
• [Publications] Hisato Kuniyoshi et al.: "Structureーactivity relationship of pheromone biosynthesis activating neuropeptide (PBAN) from the silkmoth,Bombyx mori" Peptide Chemistry 1990. (1991)
• [Publications] 石崎 宏矩: "カイコ脳ホルモン研究の展開1.序章" 細胞工学. 9. 357-362 (1990)
• [Publications] 石崎 宏矩: "カイコ脳ホルモン研究の展開2.ボンビキシン" 細胞工学. 9. 444-452 (1990)
• [Publications] 石崎 宏矩: "カイコ脳ホルモン研究の展開3.PTTHの一次構造、および終章" 細胞工学. 9. 551-559 (1990)
• [Publications] 長澤 寛道: "カイコのインスリン様ペプチド" BIOmedica. 5. 1264-1267 (1990)
• [Publications] 長澤 寛道: "性フェロモンの生合成とその調節" 農化誌. 64. 1758-1760 (1990)
• [Publications] Masafumi Iwami(Eds.Ohnishi,E.and Ishizaki,H.): "Molting and Metamorphosis" Japan Scientific Societies Press,Tokyo,and SpringerーVerlag,Heidelberg, 18 (1990)
• [Publications] Akira Mizoguchi(Eds.Ohnishi,E.and Ishizaki,H.): "Molting and Metamorphosis" Japan Scientific Societies Press,Tokyo,and SpringerーVerlag,Heidelberg, 16 (1990)
• [Publications] Hiromichi Nagasawa,et al.(Eds.Ohnishi,E.and Ishizaki,H.): "Molting and Metamorphosis" Japan Scientific Societies Press,Tokyo,and SpringerーVerlag,Heidelberg, 16 (1990)
• [Publications] Hiroshi Kataoka,et al.: "Biologically Active Peptides in Insect" American Chemical Society, (1991)
• [Publications] Akinori Suzuki(Eds.Borkovec,A.B.and Masler,E.P.): "Insect Neurochemistry and Neurophysiology" Humana Press,New Jersey, 4 (1990)