1989 Fiscal Year Annual Research Report
プレプロ構造を導入した酵素蛋白質の局在性とプロセシング
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01470120
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
山根 國男 筑波大学, 生物科学系, 教授 (20013336)
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| Keywords | 枯草菌 / 蛋白質の分泌 / プロセシング / 人為的融合蛋白質 / プレプロ構造 |
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| Research Abstract |
多くの蛋白質やホルモンは分子量の大きな前駆体として合成され、プロセシングを受けて完成型となる。この過程の間に酵素やホルモンは本来働くべき部位に移行し、活性化される。蛋白質の移行に関しては膜透過やオルガネラへの移行に見られる種々のシグナル(シグナルペプチド等のアミノ酸配列)の存在が明らかにされてきた。しかし、そのプロセシングに関係する酵素等の解析についての研究は少い。枯草菌および大腸菌における分泌蛋白質の局在性・膜透過・プロセシングの過程の解析およびフロセシングに関与する酵素群の解析を行うために、枯草菌α-アミラ-ゼ高生産株Bacillus subtilis NA64より遺伝子をクロ-ン化し、そのプロモ-タ-およびシグナルペプチドをコ-ドするDNA断片を調整した。次に指標酵素としてB.stearotherusophilus A631の耐熱性α-アミラ-ゼを利用するために、その遺伝子をクロ-ン化し、そのプロモ-タ-およびシグナルペプチドをコ-ドするDNA部分を除いた、完成型酵素部分をコ-ドするDNAを得て、HindIIIリンカ-DNAを介して連結させた。その結果amyE^1-amyT融合遺伝子が構築できた。そこでpBR322DNAを製限酵素で分解し、小断片を調整後、HindIII末端を付加し、融合遺伝子のHindIII切断部位に導入した。reading frameが正しい融合遺伝子ではプレプロ構造を持った融合蛋白質が合成され、培地中に分泌生産された。導入された多くのプロ構造によって、耐熱性α-アミラ-ゼの生産は阻害された。阻害の割合は大腸菌と枯草菌ではほぼ同じであった。しかし、分泌生産された融合蛋白質は一部分解されるか又は分解されずに存在していたのに対し、枯草菌の培地中のものは融合部分が完全に切断除去され、完成型と同じ分子量のもののみが得られた。
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[Publications] J.Nakamura,K.Yamane,K.Yoda and M.Yamasaki: "Amplification of an integration Plasmid intrduced into the tmrA amplification unit of a Bacillus subtilis tunicamycin-resistant mutant." Agric.Biol.Chem.53. 19-24 (1989)
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[Publications] K.Nakamura,Y.Fujita,Y.Itoh,and K.Yamane: "Modification of length,hydrophobic properties and electric charge of B.subtilis α-amylase signal peptide and their different effect on the production of secretory proteins in B.subtilis and E.coli cells." Mol.Gen.Genet.216. 1-9 (1989)
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[Publications] K.Kimura,S.Kataoka,A.Nakamura,T.Takano,S.Kobayshi,K.Yamane: "Function of the COOH-terminal region of cyclodextrin glucanotransferase of alkalophilic Bacillus sp.#1011:relation to catalyzing activity and pH Stability." Biochem.Biophys.Res.Commun.161. 1273-1279 (1989)
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[Publications] H.Sasamoto,K.Nakazawa,K.Tsutsumi,K.Yamane: "Singnal peptide of Bacillus subtilis α-amylase" J.Biochem. 106. 376-382 (1989)
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[Publications] J.Yamamoto,M.Shimizu,K.Yamane: "Nucleotide sequence of the diaminopimelate-decarboxylase gene from Bacillus subtilis" Nucleic Acids Res.17. 10105-10105 (1989)
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[Publications] K.Nakamura,A.Nakamura,H.Takamatsu,H.Yoshikawa,K.Yamane: "Cloning and characterization of a Bacillus subtilis gene homologous to E.coli secY." J.Biochem.
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[Publications] K.Kimura,Y.Ishii,S.Kataoka,T.Takano and K.Yamane: "Expression of the β-cyclodextrin glucanotransferase gene of an alkalophilic Bacillus sp.#1011 in Escherichia coli cells and characterization of the synthesized enzyme." Agric.Biol.Chem.54. 641-648 (1990)
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[Publications] 山根國男: "枯草菌のα-アミラ-ゼ" 微生物. 15. 48-60 (1989)
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[Publications] 山根國男: "DNAシ-ケンサ-" 植物細胞工学. 2. 61-68 (1990)
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[Publications] K.Yamane: "Extracellular enzymes of B.subtilis.Ed.by B.Maruo and H.Yoshikawa Bacillus subtilis molecular biology and industrial apprication" Elsevier, 162-189 (1989)
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[Publications] 山根國男: "枯草菌による有用蛋白質の分泌生産「特異な機能を有する微生物とその応用」バイオ高分子研究会編" 学会出版センタ-, 57-76 (1989)
