1990 Fiscal Year Annual Research Report

プレプロ構造を導入した酵素蛋白質の局在性とプロセシング

Research Project

Project/Area Number	01470120
Research Institution	University of Tsukuba
Principal Investigator	山根國男筑波大学, 生物科学系, 教授 (20013336)
Keywords	蛋白質のプロセシング / アルカリ性プロテア-ゼ / 耐熱性αーアミラ-ゼ / 融合蛋白質 / <Bacillus>___ー <subtilis>___ー / マチュレ-ション
Research Abstract	枯草菌分泌蛋白質のプロセシングのメカニズムについて解析するため,31アミノ酸残基からなる枯草菌αーアミラ-ゼ・シグナルペプチドをコ-ドするDNAとB__ー.<stearo thermophilus>___ー田未完成型耐熱性αーアミラ-ゼのDNAの間に大腸菌プラスミドpBR322より制限酵素切断によって得られる小断片を導入した複合プラスミドを構築した。得られたもののうち,pTUBE638は21残基からなるペプチドが導入され,その結果約1.7倍の耐熱性αーアミラ-ゼを分泌生産することができた。このプラスミド中の耐熱性αーアミラ-ゼ遺伝子を大腸菌で発現させると,耐熱性αーアミラ-ゼのN末端にコノアミノ酸残基余分に持った前駆体として,ペリプラズムに存在していた。一方枯草菌では18アミノ酸残基余分に持った前駆体が培養初期に分泌され,その後プロセシングを受けて,完成型αーアミラ-ゼと同じN末端を持つ酵素とそれより1アミノ酸残基余分に持った酵素とに1:3の割合で作られた。枯草菌で起っているプロセシングに関係している酵素を検索するため,プロテア-ゼ阻害剤であるEDTA,PMSF,Antipain,pepstatin,Chymostatinについて,それらの阻害効果を調べた。PMSHで完全に阻害されることから,枯草菌の主要菌体外プロテア-ゼであるアルカリ性プロテア-ゼが関係している可能性が考えられた。そこで<in>___ー <vitro>___ー系を開発し,このプロセシングを解析するために,大腸菌より前駆体を調製し,枯草菌より調製したプロテア-ゼを用いて解析した。その結果アルカリ性プロテア-ゼが主要なプロセシング酵素として働いていることが明らかとなった。アルカリ性プロテア-ゼの酵素活性としての至適pHは10.5であるが,プロセシングにおける至適pHは8.0〜9.0であった。

Research Products
(8 results)

All Other

All Publications (8 results)

[Publications] Itoh,Y.,Kanoh,K.,Nakamura,K.,Takase,K.,and Yamane,K.: "Artificial insertion of peptides between signal peptide and mature protein:effect on secretion and processing of hybrid thermostable αーamylases in <Bacillus>___ー <subtilis>___ー and <Escherichia>___ー <coli>___ー cells." J.Gen.Microbiology. 136. 1551-1558 (1990)
[Publications] Itoh,Y.,Sumi,M.,Nakamura,K.,and Yamane,K.: "Processing of an NH_2ーterminally extended thermostable αーamylase by <Bacillus>___ー <subtilin>___ー alkaline protease." J.Biohem.108. 954-959 (1990)
[Publications] Kimura,K.,Ishii,Y.,Kataoka,S.,Takano,T.,and Yamane,K.: "Expression of the βーcyclodextrin glucanotransferase gene of an alkalophilic <Bacillus>___ー sp.#1011 in <Escherichia>___ー <coli>___ー cells and characterization of the synthesized enzyme." Agric.Biol.Chem.54. 641-648 (1990)
[Publications] Nakamura,K.,Nakamura,A.,Takamatsu,H.,Yoshikawa,H.,and Yamane,K.: "cloning and Characterization of a <Bacillus>___ー <subtilis>___ー gene homologous to E__ー.<coli>___ー <secY>___ー." J.Biochem.107. 603-607 (1990)
[Publications] Nakamura,K.,,Takamatsu,H.,Akiyama,Y.,Ito,K.,and Yamane,K.: "Complementation of the protein transport dafect of an <Escherichia>___ー <coli>___ー <secY>___ー mutant (<secY24>___ー) by <Bacillus>___ー <subtilis>___ー <secY>___ー homologue." FEBS Letters.273. 75-78 (1990)
[Publications] Sadaie,Y.,Takamatsu,H.,Nakamura,K.,and Yamane,K.: "Sequencing reveals similarity of the wildーtype <dicet>___ー gene of <Bacillus>___ー <subtilis>___ー to the <Escherichia>___ー <coli>___ー <secA>___ー gene." Gene. (1991)
[Publications] 山根國男: "バイオサイエンス戦略マニュアル(瀬野悍二編)分担細菌・ウィルス・プラスミド" 共立出版, 675-679 (1990)
[Publications] Yamane,K.,Itoh,Y.,Nakamura,K.,Tsutsumi,K.,Takase,Y.: "Genetics and Biotechmology of Bacilli(ed.by J.A.Hoch) signal peptide cleavage and processing of artificial erctracellular hybrid αーamylases is <Bacillus>___ー <subtilis>___ー." Academic Press Inc.,

1990 Fiscal Year Annual Research Report

プレプロ構造を導入した酵素蛋白質の局在性とプロセシング

Principal Investigator

山根國男筑波大学, 生物科学系, 教授 (20013336)

Research Products

[Publications] Itoh,Y.,Sumi,M.,Nakamura,K.,and Yamane,K.: "Processing of an NH_2ーterminally extended thermostable αーamylase by <Bacillus>_ー <subtilin>_ー alkaline protease." J.Biohem.108. 954-959 (1990)

[Publications] Kimura,K.,Ishii,Y.,Kataoka,S.,Takano,T.,and Yamane,K.: "Expression of the βーcyclodextrin glucanotransferase gene of an alkalophilic <Bacillus>_ー sp.#1011 in <Escherichia>_ー <coli>___ー cells and characterization of the synthesized enzyme." Agric.Biol.Chem.54. 641-648 (1990)

[Publications] Nakamura,K.,Nakamura,A.,Takamatsu,H.,Yoshikawa,H.,and Yamane,K.: "cloning and Characterization of a <Bacillus>_ー <subtilis>_ー gene homologous to Eー.<coli>_ー <secY>___ー." J.Biochem.107. 603-607 (1990)

[Publications] Nakamura,K.,,Takamatsu,H.,Akiyama,Y.,Ito,K.,and Yamane,K.: "Complementation of the protein transport dafect of an <Escherichia>_ー <coli>_ー <secY>_ー mutant (<secY24>_ー) by <Bacillus>_ー <subtilis>_ー <secY>___ー homologue." FEBS Letters.273. 75-78 (1990)

[Publications] Sadaie,Y.,Takamatsu,H.,Nakamura,K.,and Yamane,K.: "Sequencing reveals similarity of the wildーtype <dicet>_ー gene of <Bacillus>_ー <subtilis>_ー to the <Escherichia>_ー <coli>_ー <secA>_ー gene." Gene. (1991)

[Publications] 山根國男: "バイオサイエンス戦略マニュアル(瀬野悍二編)分担細菌・ウィルス・プラスミド" 共立出版, 675-679 (1990)

[Publications] Yamane,K.,Itoh,Y.,Nakamura,K.,Tsutsumi,K.,Takase,Y.: "Genetics and Biotechmology of Bacilli(ed.by J.A.Hoch) signal peptide cleavage and processing of artificial erctracellular hybrid αーamylases is <Bacillus>_ー <subtilis>_ー." Academic Press Inc.,

1990 Fiscal Year Annual Research Report

プレプロ構造を導入した酵素蛋白質の局在性とプロセシング

Principal Investigator

山根 國男 筑波大学, 生物科学系, 教授 (20013336)

Research Products

[Publications] Itoh,Y.,Sumi,M.,Nakamura,K.,and Yamane,K.: "Processing of an NH_2ーterminally extended thermostable αーamylase by <Bacillus>___ー <subtilin>___ー alkaline protease." J.Biohem.108. 954-959 (1990)

[Publications] Nakamura,K.,Nakamura,A.,Takamatsu,H.,Yoshikawa,H.,and Yamane,K.: "cloning and Characterization of a <Bacillus>___ー <subtilis>___ー gene homologous to E__ー.<coli>___ー <secY>___ー." J.Biochem.107. 603-607 (1990)

[Publications] Nakamura,K.,,Takamatsu,H.,Akiyama,Y.,Ito,K.,and Yamane,K.: "Complementation of the protein transport dafect of an <Escherichia>___ー <coli>___ー <secY>___ー mutant (<secY24>___ー) by <Bacillus>___ー <subtilis>___ー <secY>___ー homologue." FEBS Letters.273. 75-78 (1990)

[Publications] Sadaie,Y.,Takamatsu,H.,Nakamura,K.,and Yamane,K.: "Sequencing reveals similarity of the wildーtype <dicet>___ー gene of <Bacillus>___ー <subtilis>___ー to the <Escherichia>___ー <coli>___ー <secA>___ー gene." Gene. (1991)

[Publications] 山根 國男: "バイオサイエンス戦略マニュアル(瀬野悍二編)分担 細菌・ウィルス・プラスミド" 共立出版, 675-679 (1990)

[Publications] Yamane,K.,Itoh,Y.,Nakamura,K.,Tsutsumi,K.,Takase,Y.: "Genetics and Biotechmology of Bacilli(ed.by J.A.Hoch) signal peptide cleavage and processing of artificial erctracellular hybrid αーamylases is <Bacillus>___ー <subtilis>___ー." Academic Press Inc.,

山根國男筑波大学, 生物科学系, 教授 (20013336)

[Publications] Itoh,Y.,Sumi,M.,Nakamura,K.,and Yamane,K.: "Processing of an NH_2ーterminally extended thermostable αーamylase by <Bacillus>_ー <subtilin>_ー alkaline protease." J.Biohem.108. 954-959 (1990)

[Publications] Nakamura,K.,Nakamura,A.,Takamatsu,H.,Yoshikawa,H.,and Yamane,K.: "cloning and Characterization of a <Bacillus>_ー <subtilis>_ー gene homologous to Eー.<coli>_ー <secY>___ー." J.Biochem.107. 603-607 (1990)

[Publications] Nakamura,K.,,Takamatsu,H.,Akiyama,Y.,Ito,K.,and Yamane,K.: "Complementation of the protein transport dafect of an <Escherichia>_ー <coli>_ー <secY>_ー mutant (<secY24>_ー) by <Bacillus>_ー <subtilis>_ー <secY>___ー homologue." FEBS Letters.273. 75-78 (1990)

[Publications] Sadaie,Y.,Takamatsu,H.,Nakamura,K.,and Yamane,K.: "Sequencing reveals similarity of the wildーtype <dicet>_ー gene of <Bacillus>_ー <subtilis>_ー to the <Escherichia>_ー <coli>_ー <secA>_ー gene." Gene. (1991)

[Publications] 山根國男: "バイオサイエンス戦略マニュアル(瀬野悍二編)分担細菌・ウィルス・プラスミド" 共立出版, 675-679 (1990)

[Publications] Yamane,K.,Itoh,Y.,Nakamura,K.,Tsutsumi,K.,Takase,Y.: "Genetics and Biotechmology of Bacilli(ed.by J.A.Hoch) signal peptide cleavage and processing of artificial erctracellular hybrid αーamylases is <Bacillus>_ー <subtilis>_ー." Academic Press Inc.,