蛋白質工学的手法による細胞シトクロムC耐熱機構の解明

1989 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 01470122
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 児玉 徹 東京大学, 農学部, 教授 (30011901)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石井 正治 東京大学, 農学部, 助手 (30193262)
• Keywords: シトクロムC / 耐熱化機構

Research Abstract

1.好熱性水素細菌Hydrogenobacter thermophilus由来シトクロムC遺伝子のクロ-ニング及びシ-クエンス決定
H.thermophilus染色体DNAをHind IIIで消化し、シトクロムCの蛋白の配列から作成した2種類の合成オリゴヌクレオチドをプロ-ブとしてシトクロムC遺伝子をクロ-ニングした。得られた2.5kbの断片をAcc I-Pst I処理により1.1kbまでサブクロ-ニングしたのちシ-クエンスを行った。
2.H.thermophilusシトクロムC遺伝子の他種生物による発現
(1)酵母における発現 宿主としてヘムCを著量合成することが知られているSaccharomyces cerevisiaeを用いた。シトクロムC遺伝子のうち5'上流のリ-ダ-シ-クエンスまで含むものと含まないものの2種の遺伝子を用いて宿主の形質転換を行った。どちらの遺伝子を用いた場合でもアポ蛋白は宿主内で合成されなかったが、リ-ダ-シ-クエンスを含まない遺伝子を用いて形質転換された宿主内ではホロ蛋白が合成されていることがシトクロムCに対する抗体を用いることにより明らかとなった。
(2)大腸菌における発現 (1)と同様に2種の遺伝子を用いて大腸菌を形質転換し、硝酸呼吸条件下に培養した。リ-ダ-シ-クエンスを含まない遺伝子を用いて形質転換された宿主内でアポ蛋白が合成されていることが示された。
3.Pseudomonas aeruginosa由来シトクロムC遺伝子のクロ-ニング及びシ-クエンス決定
既に報告のあるP.aeruginosaシトクロムC蛋白のアミノ酸配列から2種類のオリゴヌクレオチドを合成し、これをプロ-ブとしてP.aeruginosa染色体DNAからシトクロムC遺伝子をクロ-ニングした。得られた9kbのPst I断片をSal I処理により1kbまでサブクロ-ニングしたのちシ-クエンスを行った。